張世能， 莊曉虹， 唐 健， 莊燕妍， 黃鳳婷， 陳文博， 程文捷

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120;2海南省農(nóng)墾總醫(yī)院腫瘤血液科，海南?？?71103)

微小RNA(microRNA)是一類真核生物內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，長度通常為18～25個核苷酸，microRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制抑制靶基因表達(dá)而發(fā)揮“癌基因”或“抑癌基因”作用［1］。胰腺癌早期診斷困難，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后惡劣。既往胰腺癌的分子機制研究多關(guān)注于編碼基因的作用，隨著非編碼RNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究的不斷深入，業(yè)已顯示胰腺癌存在特異的microRNA表達(dá)譜，研究表明血清miR－196水平與胰腺癌預(yù)后相關(guān)［2］。采用化學(xué)合成的反義microRNA，可以特異地靶向敲除單個的microRNA分子，從而達(dá)到下調(diào)某microRNA活性的目的［3］。本研究中，我們首先檢測胰腺癌細(xì)胞系miR－196a的表達(dá)狀況，在此基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的反義miR－196a，觀察反義miR－196a對胰腺癌細(xì)胞PANC－1體外增殖、侵襲和遷移能力的影響作用及其機制，以期探討胰腺癌轉(zhuǎn)移的新機制和防治的新靶點。

材料和方法

1 細(xì)胞及主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞系CAPAN－2、BXPC－3、SW1990和PANC－1由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化實驗室保存，體外培養(yǎng)傳代。永生化人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系H6c7由加拿大安大略癌癥研究所Prof.Mingsound Tsao惠贈，體外培養(yǎng)傳代。miR－196a(貨號: 4373104)及其引物 RNU6B(貨號:4363381)購自ABI。反義miR－196a和miR－negative control(NC)購自上海吉瑪公司。LipofectamineTM2000(Lipo)、Opti－MEM培養(yǎng)基、K－SFM培養(yǎng)基、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase Kit)和PCR試劑購自Invitrogen。DMEM液體培養(yǎng)基、重組表皮生長因子 (recombinant epidermal growth factor，rEGF)、牛垂體提取物(bovine pituitary extract，BPE)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Gibco。Transwell板購自Corning。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液或傳代1次，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液消化，完全培養(yǎng)基中和。H6c7細(xì)胞培養(yǎng)于K－SFM培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.2 μg/L rEGF和20 mg/L BPE)在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，采用0.05%胰蛋白酶消化，以0.4%BSA 1∶1中和。

2.2 實驗分組 反義miR－196a組:使用Lipo將反義miR－196a轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞(終濃度100 nmol/L);miR－NC組:使用Lipo將miR－NC(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞;Lipo組:僅轉(zhuǎn)染Lipo的PANC－1細(xì)胞;空白組:常規(guī)培養(yǎng)的PANC－1細(xì)胞，不加Lipo和microRNA片段。各組在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h，觀察細(xì)胞增殖情況，轉(zhuǎn)染后48 h檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移能力。

2.3 實時熒光定量PCR檢測miR－196a表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞，采用 Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。取2 μg總RNA，用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，應(yīng)用LightCycler 480型實時熒光定量PCR儀(Roche)進行PCR定量檢測。PCR條件:95℃15 s，60℃30 s，74℃ 30 min，40個循環(huán)。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值;以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，各組細(xì)胞中miR－196a相對表達(dá)率采用2－ΔΔCt法計算。

2.4 細(xì)胞計數(shù)試劑盒－8(cell counting kit－8，CCK－8)檢測細(xì)胞增殖 具體方法參照CCK－8試劑盒說明書進行。將PANC－1細(xì)胞按1×104cells/well接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/well)中，適時轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h，每孔加入10 μL CCK－8試劑，5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止孵育，上機檢測(以培養(yǎng)基+10 μL CCK－8作為空白調(diào)零孔)。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔450 nm和630 nm雙波長處吸光度(A)。每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組轉(zhuǎn)染后48 h，制備單細(xì)胞懸液，4℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌、離心、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/ L。按照Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒說明書染色后使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分率(%)表示。實驗重復(fù)3次。

2.6 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 取出Matrigel，在冰上融化，按1∶8稀釋(用不完全DMEM)，取50 μL在Transwell上室制備人工基底膜，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h后備用。各組細(xì)胞用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基洗2次后，調(diào)整細(xì)胞密度為109/L，各取100 μL接種到Transwell小室內(nèi)，每組重復(fù)3孔;同時在24孔板內(nèi)(下室)加入500 μL含20% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)8 h后取出小室，用棉簽擦去上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色15 min;洗滌殘余染料，倒置顯微鏡觀察并拍照，每組隨機選取10個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.7 Transwell細(xì)胞遷移實驗 除不用Matrigel在Transwell上室制備人工基底膜外，余下方法同前侵襲實驗。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.8 螢光素酶報告基因的檢測 microRNA靶點預(yù)測軟件(PicTar、TargetScan和miRanda)提示核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor κB inhibitor α，NFKBIA)mRNA 3'UTR的390～396位點是miR－196a的可能結(jié)合位點(binding site，BS)。體外合成該位點的DNA片段并將該序列插入到psi－CHECKTM－2載體(Promega)海腎螢光素酶編碼基因的下游，構(gòu)建成野生型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體。根據(jù)microRNA與靶基因結(jié)合的特點，設(shè)計引物對miR－196a與NFKBIA的3'UTR相結(jié)合的種子序列區(qū)進行突變，構(gòu)建成突變型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落經(jīng)99℃、5 min熱裂解，取上清做PCR鑒定陽性克隆，并以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進行Xho I和Not I雙酶切和測序鑒定，酶切產(chǎn)物以含溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。載體鑒定成功后，將野生型/突變型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體與反義 miR－196a/對照 microRNA共轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞，每組重復(fù)3復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙螢光素酶檢測試劑盒(E1910，Promega)檢測海腎螢光素酶的活性，同時檢測螢火蟲熒光素酶活性作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1 miR－196a在胰腺癌細(xì)胞系及H6c7中的表達(dá)

本實驗以永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮H6c7細(xì)胞為陽性對照，檢測胰腺癌細(xì)胞系CAPAN－2、BXPC－3、SW1990和PANC－1中miR－196a的表達(dá)，結(jié)果顯示:與H6c7細(xì)胞相比，人胰腺癌細(xì)胞系中miR－196a的表達(dá)水平明顯上調(diào)，見圖1。本課題選擇PANC－1為進一步的研究對象。

Figure 1.Overexpression of miR－196a in pancreatic cancer cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs H6c7.圖1 胰腺癌細(xì)胞miR－196a的過表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染反義miR－196a后PANC－1細(xì)胞中miR－196a的表達(dá)變化

如圖2所示，定時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，若以miR－NC組細(xì)胞的miR－196a表達(dá)量作為1，反義miR－196a轉(zhuǎn)染組PANC－1細(xì)胞miR－196a表達(dá)量約為0.2，明顯下調(diào)近80%(P＜0.01)。而其它3組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Figure 2.Anti－miR－196a down－regulated the expression of miR－196a in PANC－1 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs other groups.圖2 反義miR－196a的轉(zhuǎn)染下調(diào)PANC－1細(xì)胞miR－196a的表達(dá)

3 轉(zhuǎn)染反義miR－196a對PANC－1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK－8法檢測轉(zhuǎn)染后的PANC－1細(xì)胞的各組間的細(xì)胞增殖能力，對各組所測得的A值進行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各組間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:反義miR－196a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為15.45%± 7.99%，miR－NC組為15.57% ±5.45%，Lipo組為14.47%±6.47%，空白組為9.79% ±4.40%，見圖3。統(tǒng)計學(xué)分析顯示各組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P＞0.05)。這些結(jié)果表明反義 miR－196a轉(zhuǎn)染對PANC－1細(xì)胞體外增殖和凋亡無顯著影響。

Figure 3.Inhibitory effect of miR－196a down－regulation on the apoptosis of PANC－1 cells 48 h after transfection detected by flow cytometry.A:blank control group;B:Lipo group;C:miR－NC group;D:anti－miR－196a group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染反義miR－196a對PANC－1細(xì)胞凋亡的影響

4 轉(zhuǎn)染反義miR－196a對PANC－1細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

在200倍光鏡下觀察可見空白組細(xì)胞有一定的侵襲和遷移能力，48 h每個視野下侵襲(遷移)數(shù)為106.3±11.2(61.0±5.0)，Lipo組為97.1±13.8 (56.0±7.0)，miR－NC組為98.2±12.9(58.2± 5.6)，反義 miR－196a組為 56.3±7.1(32.3± 4.6)。與其它3組比較，反義miR－196a組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯受抑(P＜0.01)，而其它3組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

5 雙螢光素酶報告基因的檢測

生物信息學(xué)軟件預(yù)測NFKBIA可能是 miR－196a的靶基因之一，見圖5。根據(jù)預(yù)測結(jié)果構(gòu)建雙螢光素酶報告基因載體導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)后挑取單克隆菌落進行酶切鑒定和測序顯示構(gòu)建成功，見圖6。將構(gòu)建成功的雙螢光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞48 h后，分別檢測海腎螢光素酶和螢火蟲螢光素酶活性，并使用內(nèi)參螢火蟲螢光素酶對海腎螢光素酶活性進行標(biāo)準(zhǔn)化校正。結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和反義miR－196a可使海腎螢光素酶相對活性較共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和對照microRNA者顯著降低(P＜0.05)，而共轉(zhuǎn)染突變型NFKBIA的3'UTR和miR－196a則較之無明顯差異(P＞0.05)，見圖7。

討論

研究表明胰腺癌存在獨特的microRNA表達(dá)譜。zhang等［4］報道了8個microRNA在所研究的標(biāo)本中表達(dá)的陽性率達(dá)到70%～100%，表達(dá)上調(diào)差異性在3～2 018倍。它們是miR－196a、miR－190、miR－186、miR－221、miR－222、miR－200b、miR－15b和 miR－95。本課題組前期采用博奧公司和康成公司的芯片分別檢測了胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞中的microRNA表達(dá)譜，顯示miR－196a是一個在胰腺癌中表達(dá)異常增高的microRNA［5］。

Figure 4.Inhibitory effect of miR－196a down－regulation on PANC－1 cell invasion(×200).A:blank control group;B:Lipo group;C:miR－NC group;D:anti－miR－196a group.圖4 體外Transwell遷移實驗觀察下調(diào)miR－196a后對PANC－1細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

Figure 5.Identification of NFKBIA as an miR－196a target by TargetScan program.圖5 生物信息學(xué)分析NFKBIA是miR－196a的靶基因之一

miR－196a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)。Dou等［6］通過SNP分析顯示miR－196a多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險明顯相關(guān)。Peng等［7］的研究發(fā)現(xiàn)miR－196a－2突變的純合子CC與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn) miR－196a與白血?。?］、食管癌［9］、結(jié)腸癌［10］等腫瘤的分化、增殖、凋亡和遷移相關(guān)。雖然miR－196a在胰腺癌中呈高表達(dá)，且有研究表明miR－196a－2表達(dá)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)，但是miR－196a在胰腺癌中的作用遠(yuǎn)沒有被闡明。本研究通過直接瞬時轉(zhuǎn)染microRNA對miR－196a功能進行了檢測，該法優(yōu)點在于化學(xué)合成反義microRNA簡便、快捷，可避免構(gòu)建表達(dá)載體的步驟，從而有效提高特定microRNA的表達(dá)。本研究將反義miR－196a轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)miR－196a表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示反義miR－196a轉(zhuǎn)染后對PANC－1細(xì)胞增殖和凋亡無明顯影響，但對細(xì)胞體外遷移能力具有明顯抑制作用。

為了解miR－196a影響細(xì)胞侵襲遷移能力的可能機制，我們構(gòu)建含野生型或突變型NFKBIA的3' UTR螢光素酶表達(dá)載體，結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和反義miR－196a可使海腎螢光素酶相對活性較共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和對照microRNA者顯著降低，而共轉(zhuǎn)染突變型NFKBIA的3'UTR和miR－196a則較之無明顯差異。NFKBIA是IκB家族的重要成員之一，在靜息狀態(tài)下，存在于細(xì)胞胞漿中，與NF－κB的二聚體組成三聚體滯留于胞質(zhì)中而處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激時，IκB迅速降解，NF－κB被激活且從三聚體中釋放出來，借助于核定位信號進入細(xì)胞核發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NFKBIA在多種腫瘤如前列腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)。最近Bredel等［11］研究表明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NFKBIA常缺失，但不突變;NFKBIA缺失對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病的影響類似于EGFR擴增，和生存期相對較短相關(guān)。本研究初步顯示miR－196a可能參與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)控，反義miR－196a可提高NFKBIA的表達(dá)，間接阻止NF－κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)進而抑制其下游基因的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，我們將進一步開展體內(nèi)動物實驗和NF－κB信號通路相關(guān)基因的檢測以證實上述假設(shè)。

Figure 6.The electrophoresis of NFKBIA vector and double digestion for identification.M1:DL2000 DNA marker; Lane 1:original plasmid;Lane 2:plasmid with double digestion;M2:1 kb DNA marker;yellow arrow: NFKBIA;red arrow:psi－CHECKTM－2 vector.圖6 NFKBIA雙螢光素酶報告基因雙酶切鑒定電泳圖

Figure 7.The cotransfection of wild－type NFKBIA 3＇－UTR and anti－miR－196a significantly down－regulated the relative activity of Renilla luciferase(Rluc)normalized to firefly luciferase(Fluc)compared with other groups，while there was no significant difference when cotransfected with mutant－type NFKBIA 3＇－UTR and anti－miR－196a.±s.n=3.*P＜0.05 vs other groups.圖7 雙螢光素酶報告基因的檢測

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