孫 青 傅廣波 莊海軍 王云炎 牛曉兵

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院泌尿外科 淮安 223300

1 RNAi的歷史背景

RNAi是生物體內(nèi)的一種通過雙鏈RNA(dsRNA)來抵抗病毒入侵和抑制轉(zhuǎn)座子活動的自然機(jī)制，是生物學(xué)中的普遍現(xiàn)象［1］。RNAi現(xiàn)象早在1993年就有報道:將產(chǎn)生紫色素的基因轉(zhuǎn)入開紫花的矮牽牛中，希望得到紫色更深的花，卻事與愿違成了白色。當(dāng)時認(rèn)為這是矮牽牛本來有的紫色素基因和轉(zhuǎn)入的外來紫色素基因都失去了功能，稱這種現(xiàn)象為“共抑制”。直到1998年，F(xiàn)ire等［2］將正義RNA與反義RNA以及一段與基因序列同源的反義RNA和模板RNA復(fù)性退火后的雙鏈分別注入到線蟲體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過純化的單鏈RNA在基因抑制方面的效應(yīng)非常微弱，而經(jīng)過純化的dsRNA卻能高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個數(shù)量級，他們將觀察到的現(xiàn)象稱為RNAi，由此揭開了研究siRNA特異性基因沉默機(jī)制的序幕。

2 RNAi的作用機(jī)制

在RNAi作用的起始階段中外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA被Dicer酶切割為19～2lbp的小分子干擾RNA片段(small interfering RNA，siRNA);隨后siRNA與核酶復(fù)合物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA－induced silencing complex，RISC)。RISC特異性地與細(xì)胞內(nèi)同源mRNA結(jié)合后，隨即被內(nèi)切酶切割，于是mRNA片段由于缺少聚腺苷酸尾或穩(wěn)定的帽子結(jié)構(gòu)而很快被降解，最終導(dǎo)致基因的沉默［3－8］(見圖1、2)。從發(fā)現(xiàn)至今，在短短幾年中，對RNAi的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，RNAi以其快速、簡便、特異、高效等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于基因功能研究，腫瘤治療和抗病毒感染等領(lǐng)域。應(yīng)用siRNA技術(shù)特異地封閉在細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、突變失活的抑癌基因、凋亡相關(guān)基因等，使基因表達(dá)降低，癌細(xì)胞生長受抑制，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。RNAi已顯示其具有許多傳統(tǒng)技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢:(1)高特異性:RNAi只對同源mRNA有作用，而對其他mRNA的表達(dá)則無影響;(2)高效性:siRNA能在低于反義核酸幾個數(shù)量級的濃度下，顯著抑制基因表達(dá)甚至完全沉默，從而產(chǎn)生缺失突變體表型，比基因敲除更快更簡單;(3)高穩(wěn)定性:以3'端懸垂TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定;(4)高穿透性:RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持。這些優(yōu)點(diǎn)使siRNA成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)。RNAi與其他療法如放化療和免疫治療等結(jié)合，可為腫瘤的治療開辟一條新的途徑，特別是廣泛應(yīng)用于多種腫瘤如肺癌、腎癌、前列腺癌及病毒感染性疾病診斷和治療的臨床前研究［6］。

圖1 siRNA形成機(jī)制示意圖

圖2 RNAi作用機(jī)制示意圖

3 RNA干擾的化學(xué)修飾

當(dāng)前，RNAi類核酸藥物根據(jù)修飾成分的不同可分為以下三種:裸siRNA(即未經(jīng)修飾的siRNA)、載體連接的siRNA及化學(xué)修飾的siRNA。裸siRNA由于分子穩(wěn)定性差，易被核酶降解，體內(nèi)分布廣泛，細(xì)胞攝取困難，存在靶外基因沉默現(xiàn)象和免疫刺激等，所以應(yīng)用范圍不廣。而載體連接的siRNA采用腺病毒、質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等載體，則具有一些弊端［9］:如插入的外源性基因不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞、可能與內(nèi)源性基因發(fā)生重組、病毒載體本身可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)并可能通過插入突變激活細(xì)胞的癌基因，導(dǎo)致惡性腫瘤，價格較貴、構(gòu)建過程相對復(fù)雜且在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄失活現(xiàn)象。鑒于上述風(fēng)險，所以傳統(tǒng)載體連接的siRNA還不能滿足臨床長效性、經(jīng)濟(jì)性和安全性的需要，而將siRNA采用親脂性化學(xué)基團(tuán)等化學(xué)修飾后，具有某些優(yōu)點(diǎn)，如提高siRNA的穩(wěn)定性和RNAi活性、能抵抗核酸酶的降解作用、避免脫靶，siRNA可進(jìn)行標(biāo)記，利于被細(xì)胞攝取、不具有病毒載體潛在的風(fēng)險性，方法簡單、快速，需要時間短，獲得的siRNA純度高等，而逐漸引起人們的重視［10］。siRNA的化學(xué)修飾主要有以下四類:磷酸骨架修飾、核糖修飾、堿基修飾和鎖核酸［11］。

3.1 磷酸骨架結(jié)構(gòu) 連接在RNA磷酸骨架的磷酸二酯鍵(phosphodiester linkage)是核酸酶作用的關(guān)鍵化學(xué)鍵，而磷原子是核酸酶攻擊的重要靶點(diǎn)，所以研究最多的化學(xué)修飾是磷原子，對磷原子稍加修改即會大大的影響酶的降解作用，如硫代修飾等。硫代修飾最初廣泛應(yīng)用于反義技術(shù)，來提高寡聚核苷酸對核酸酶的抗性，硫代磷酸是用一個硫原子取代磷酸二酯鍵的非橋氧原子，即P－S鍵代替P－O鍵，提高了siRNA抗核酸酶的能力，增加其穩(wěn)定性。研究證實(shí)，核糖4'位O－S置換后的siRNA穩(wěn)定性提高600倍，但對其RNAi的作用有一定程度的抑制。4'－S修飾在提高siRNA穩(wěn)定性的同時，因其修飾堿基位置和數(shù)量的不同都可以產(chǎn)生不同程度的RNAi效果［12］。

3.2 核糖修飾 對核苷酸戊糖2'－OH的修飾是對siRNA最重要的修飾。siRNA在體內(nèi)水解時，在RNA酶催化下，3'磷脂鍵斷開，與2'－OH形成環(huán)狀磷酸二脂，最終形成水解產(chǎn)物。核糖的2'位置可進(jìn)行多種修飾，如氟、甲基等，可提高siRNA分子核酸酶抵抗力，提高其穩(wěn)定性。DePaula D 等實(shí)驗(yàn)［13－22］指出，2'－OH不是siRNA發(fā)揮效用的必須基團(tuán)，對siRNA所在單、雙鏈的化學(xué)修飾都不會影響其基團(tuán)沉默效果，而且5'端修飾效果強(qiáng)于3'端。在Allerson等［23］研究中，對 siRNA主鏈核糖殘基2'位完全用甲氧基(2'－OMe)或氟(2'－F)進(jìn)行取代，可增強(qiáng)其血獎中的穩(wěn)定性及體外的RNAi活性，基因沉默效果是未經(jīng)修飾siRNA的大約500倍。Czauderna等［24］等實(shí)驗(yàn)證明，siRNA的3’或5’末端經(jīng)2'－OMe修飾，可增強(qiáng)該修飾siRNA抵抗血漿源性核酸酶的降解作用，且不降低RNAi干擾活性。

3.3 堿基修飾 siRNA與mRNA通過堿基互補(bǔ)之間形成氫鍵，發(fā)揮RNAi的作用，因此通過對堿基進(jìn)行修飾，加強(qiáng)堿基與堿基之間的相互作用。在尿嘧啶的5’位點(diǎn)引入溴或碘是最常使用的堿基修飾方法，如5－溴－尿嘧啶和5－碘－尿嘧啶可加強(qiáng)腺嘌呤－尿嘧啶(A－U)之間的連接，提高堿基的相互作用，與靶mRNA的相互作用，增加RISC對后者的識別和剪切［25－26］。

3.4 鎖核酸修飾 LNA(locked nucleic acid)鎖核酸是一種新穎的寡核苷酸衍生物，LNA分子結(jié)構(gòu)中含有一個或多個2'－O，4'－C－亞甲基－β－D－呋喃核糖核酸單體，核糖的2'－O位和4'－C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、胺亞甲基橋或硫亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3'－內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，從而增加磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，故其對RNA、DNA有很好的識別能力和強(qiáng)大的親和力、水溶性好、抗核酸酶降解能力及體內(nèi)無潛在致癌性等優(yōu)點(diǎn)。siRNA兩端或中間位點(diǎn)經(jīng)LNA修飾后，靶外基因沉默現(xiàn)象明顯減少，更容易與RISC結(jié)合，血清半衰期更長、活性更高。

綜上所述，siRNA的修飾方法可以歸納為以下幾點(diǎn):(1)磷酸骨架修飾主要為硫代修飾，可提高其抗水解酶降解能力，增強(qiáng)其穩(wěn)定性;(2)核糖修飾主要是2'－OH和4'－O化學(xué)基置換、加長等，是對siRNA最重要的修飾;(3)堿基修飾是用5'溴－尿嘧啶可以提高與靶mRNA的相互作用，增加RISC對后者的識別和剪切;(4)LNA修飾siRNA兩端或中間位點(diǎn)，親和力提高、水溶性好、抗核酸酶降解能力加強(qiáng)?；瘜W(xué)修飾能夠提高生物的特征如穩(wěn)定性、生物學(xué)分布和潛能性，這種修飾使得RNA治療的發(fā)展成為可能，然而目前還是在實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)用于臨床面臨著一些挑戰(zhàn)。

4 前景與展望

RNAi技術(shù)的應(yīng)用:(1)使其可以作為研究基因功能的新工具，特異性的滅活或降低特異性基因的表達(dá)，而且抑制基因表達(dá)的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。(2)成為研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新途徑。聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系。(3)成為開展基因治療的新策略。作為一種古老的抗病毒機(jī)制，RNAi用于抗病毒治療已取得一定進(jìn)展。Zhou［28］報道了以趨化因子復(fù)合體CXCR4為靶向的siRNA阻止了HIV－1細(xì)胞融合。導(dǎo)致HIV－1失去抵抗大多數(shù)以趨化因子復(fù)合體為靶向的病毒抑制因子的能力。腫瘤是一種多基因疾病，可以將多種癌基因作為靶基因設(shè)計出相對應(yīng)的siRNA。Krishnamachary等［29］將人工合成的 siRNA/HIF－1a導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)siRNA能高度抑制HIF－1a及其下游基因MMP－2等的表達(dá)，明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

雖然應(yīng)用RNAi技術(shù)已經(jīng)取得許多令人振奮的研究成果，但仍有多方面問題有待解決:(1)RNAi作用存在衰減現(xiàn)象;(2)RNAi在哺乳動物體內(nèi)的應(yīng)用尚缺乏器官靶向性;(3)RNAi具有高度特異性，但有時也會出現(xiàn)脫靶(off－target)現(xiàn)象［30］;(4)RNAi導(dǎo)入動物體內(nèi)的方法及載體的選擇還需要進(jìn)一步優(yōu)化;(5)RNAi技術(shù)中的siRNA或shRNA的導(dǎo)入可能激活體內(nèi)干擾素反應(yīng)基因，它被激活后就能夠非特異性地全面抑制內(nèi)源性mRNA的翻譯，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但隨著RNA干擾機(jī)制的徹底闡明，這些問題有望最終解決。相信在不久的將來，RNAi技術(shù)能完全成為最有效的基因治療手段而應(yīng)用于臨床。

目前的siRNA應(yīng)用的困境在于體內(nèi)穩(wěn)定性、靶向性、包膜穿透性均較差，副作用主要包括靶外效應(yīng)和免疫刺激反應(yīng)?；瘜W(xué)修飾可以克服傳統(tǒng)載體siRNA的缺點(diǎn)，在不影響RNAi活性的基礎(chǔ)上，增加其穩(wěn)定性、長效性，在siRNA的深入研究及臨床治療等領(lǐng)域具有積極和深遠(yuǎn)的影響。目前的siRNA應(yīng)用的困境在于體內(nèi)穩(wěn)定性、靶向性、包膜穿透性均較差，不良反應(yīng)主要包括靶外效應(yīng)和免疫刺激反應(yīng)?；瘜W(xué)修飾siRNA具有傳統(tǒng)載體不可比擬的優(yōu)勢，在siRNA的深入研究及臨床治療等領(lǐng)域產(chǎn)生積極和深遠(yuǎn)的影響。

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