李冬梅，孟凡立，王志坤，臧振源，孫 晶，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella Matsumurav）屬鱗翅目（Lepidoptera）小卷蛾科（Olethreutidae），是東北大豆產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的一種害蟲，以幼蟲鉆蛀豆莢取食豆粒，將豆粒咬成溝道或殘破狀，嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。豆農(nóng)每年至少使用2次化學(xué)殺蟲劑對大豆食心蟲進行防治?，F(xiàn)在使用的化學(xué)殺蟲劑多為廣譜性殺蟲劑，可殺死目標(biāo)昆蟲，也會殺死有益昆蟲。同時化學(xué)殺蟲劑在自然界可長期存在，在土壤和河流中逐漸積累，破壞土壤和河流的生態(tài)環(huán)境；化學(xué)殺蟲劑還可以通過食物鏈進入人體，誘發(fā)致畸、致癌，嚴(yán)重損害健康。利用傳統(tǒng)育種方法培育抗大豆食心蟲的大豆品種雖有效，但周期長、效率低。因而，急需探索防治大豆食心蟲的新方法，以精確、高效地控制大豆食心蟲。

Fire等在研究反義RNA在線蟲Caenorhabditis elagans中的基因阻斷作用時，首先發(fā)現(xiàn)利用純化的外源dsRNA能夠高效特異性阻斷內(nèi)源基因表達，并將這一現(xiàn)象稱為 RNAi（RNA interference）[2]。由于RNAi技術(shù)沉默基因的高效性和特異性，人們提出通過轉(zhuǎn)基因手段，讓植物體內(nèi)表達昆蟲基因的dsRNA，dsRNA經(jīng)昆蟲取食后進入蟲體內(nèi)，對昆蟲靶基因進行RNA干擾，從而特異性抑制靶基因表達，提高植物抗蟲性[3-6]。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所陳曉亞院士實驗室的研究成果證明，昆蟲取食表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物后，體內(nèi)相應(yīng)的靶基因受到抑制，提高植物的抗蟲性[7]。Mao等先通過轉(zhuǎn)基因手段，讓擬南芥和煙草表達棉鈴蟲參與棉毒素解毒的P450基因dsRNA。然后，利用轉(zhuǎn)基因植物喂食棉鈴蟲，dsRNA從食道進入細胞，抑制棉鈴蟲體內(nèi)P450基因的表達，致使棉鈴蟲對棉子酚的抗性降低。最后，對棉鈴蟲造成致命的影響[8]。孟山都公司報道表明，玉米根蟲V-ATPase基因被轉(zhuǎn)基因玉米表達的siRNA抑制，轉(zhuǎn)基因玉米根部遭受的破壞要比對照植株顯著降低[9]。以上研究結(jié)果表明，dsRNA可以通過取食從植物傳遞到昆蟲體內(nèi)，通過植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以干擾害蟲的重要基因，達到防治害蟲的目的，為利用RNAi技術(shù)培育新一代抗蟲轉(zhuǎn)基因作物提供重要的科學(xué)依據(jù)。

核糖體是普遍存在于各種細胞內(nèi)的細胞器，由大小兩個亞基組成，是蛋白質(zhì)合成的唯一場所。核糖體含有50%～60%的核糖體RNA（rRNA），其余為蛋白質(zhì)。近年，國內(nèi)外的研究表明，核糖體RNA（rRNA）不僅是構(gòu)成核糖體的主要成分，還具有自我復(fù)制和自我剪切功能[10]，在蛋白質(zhì)合成中起重要作用[11]。28SrRNA是核糖體RNA主要成員之一，是生物的關(guān)鍵生長基因。因此，本試驗根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的昆蟲28SrDNA基因序列，利用28SrDNA基因序列的保守區(qū)域，克隆大豆食心蟲28SrDNA序列全長，利用熒光定量PCR對大豆食心蟲不同生育時期和幼蟲的不同組織的28SrDNA表達量進行分析后，構(gòu)建表達大豆食心蟲28SrDNA dsRNA的重組載體L4440-28SrDNA，為進一步研究RNA干擾技術(shù)防治大豆食心蟲奠定基礎(chǔ)。

[1]Laufer,B.&P.,Nation.(1999).A Vocabulary Size Test of Controlled Productive Ability,Language Testing,16(1).33-51.

1 材料與方法

1.1 材料

2010年7月末8月初大豆田間出現(xiàn)大豆食心蟲成蟲開始，收集卵、幼蟲、蛹、成蟲四個時期的大豆食心蟲樣品，將收集的蟲樣分別放入無Rnase的EP管中，立即放入液氮中冷凍，然后存于-80℃低溫冰箱，每個處理重復(fù)3次。選取大豆食心蟲3～4齡幼蟲進行解剖，剖取神經(jīng)節(jié)、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體組織后，分別放入無Rnase的EP管中，立即放入-80℃低溫冰箱中保存。

DNA提取、PCR、電泳所用試劑均購自上海生工公司，測序由華大基因有限公司完成、OMEGA膠回收試劑盒、Trizol reagen試劑盒、MEGA4.0軟件、DNAman 5.2.2軟件、載體L4440和菌種HT115均由美國線蟲遺傳學(xué)中心提供。

嵌入式計算機在接到指定任務(wù)后，必須在規(guī)定時間內(nèi)給出實時應(yīng)答，這是區(qū)別嵌入式計算機與通用計算機的一個重要特征，實時性涉及到硬件的性能、軟件的中斷管理和調(diào)度算法等。

Design of Intelligent Balancing Vehicle Control System based on Arduino

2.3 術(shù)后硬膜下并發(fā)癥影響因素分析 單因素分析結(jié)果(表3)表明：男性、高齡、動脈瘤部位、Fisher分級、腦萎縮程度及術(shù)后腰大池引流是破裂動脈瘤夾閉術(shù)后硬膜下并發(fā)癥發(fā)生的潛在危險因素(P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 大豆食心蟲基因組DNA的提取

種植雙胞山藥最好選擇土質(zhì)疏松、地勢高燥、土層深厚、排灌方便、通氣透水、保水保肥性能好的砂壤土。鹽堿地、低洼積水地、賣窯泥地、地下異物多的地不能種山藥。

縣級設(shè)專職人影管理人員1名，作業(yè)人員4～5名(高炮作業(yè)人員除外)。防雹作業(yè)點均交由當(dāng)?shù)卣芾?，施行鄉(xiāng)鎮(zhèn)武裝部長主管、村干部管理、炮長負責(zé)的制度，每個作業(yè)點配備4名作業(yè)人員，一人為炮長，具體負責(zé)作業(yè)點管理、高炮維護、彈藥交接、作業(yè)實施及空域請示，氣象部門僅負責(zé)安全檢查、作業(yè)指導(dǎo)和空域請示等。

根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表鱗翅目昆蟲的銀月豹鳳蝶（Papilio troilus，登錄號AF423920）；家蠶（Bombyx mori，登錄號M31320）；雄鹿天蠶蛾（Hemileuca sp，登錄號AF423922）；洋槐木蠹蛾（Prionoxystus robiniae，登錄號AY521785）的28SrDNA序列，根據(jù)鱗翅目昆蟲28SrDNA序列的保守區(qū)域設(shè)計兩對簡并引物用于擴增大豆食心蟲28SrDNA序列全長，引物具體如下：

利用DNAMAN5.2.2和MEGA4.0軟件進行序列分析。

P2：ATGGTGAACTATGCCTGGT;

P3：AACTTCGGAGGGAACCG；

P4：CCCTCCCTGRATTTCAAGGTCCG。

按昆蟲DNA提取方法，利用試劑盒提取大豆食心蟲幼蟲DNA。

P1和P2預(yù)期的PCR擴增條帶大小約為1100 bp，P3和P4約為1200 bp。

1.2.3 PCR擴增與檢測

PCR反應(yīng)體系為PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，dNTPs 0.5 μL，10 mmol·L-1引物 1.0 μL，模板DNA 2.5 U 1.0 μL，ddH2O 19.7 μL。PCR循環(huán)條件為：95℃5 min；57.1℃1 min，72℃2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取4 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下擴增的目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒回收PCR目的片段。

1.2.2 引物設(shè)計

1.2.5 熒光定量PCR

actin-a：5'ATCCTCCGTCTGGACTTGGC 3'

本文針對RBC的特點，考慮風(fēng)險因素之間的影響，提出基于ANP和證據(jù)融合理論的風(fēng)險評估模型，對RBC的風(fēng)險等級進行評估。

利用Trizol reagent提取大豆食心蟲卵、幼蟲、蛹、成蟲四個時期和神經(jīng)節(jié)、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個組織的總RNA，采用Fermentas公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以cDNA為模板，利用熒光定量PCR對28SrDNA表達量進行檢測。熒光定量PCR按照TOYOBO公司SYBR?Green Realtime PCR Master Mix-Plus-程序進行。熒光定量PCR反應(yīng)中所使用的基因及其引物如下：

actin-s：5'GGCGACATAGCACAGCTTCTC 3'

那時實行大集體制，生產(chǎn)隊按照家庭人口和掙得工分的多少，定期分給社員一些稻草、棉稈、松枝之類的東西用于做飯之用，但分配的那點柴草遠遠不能滿足炊用的需要，家家都感覺到柴不夠燒。棉稈、松枝還好燒一點，稻草一燒煙大灰多，做完一餐飯，是滿面火灰，兩眼通紅。所以，弄柴就成了我們這些孩子上學(xué)之余的主要任務(wù)，逢放學(xué)或放假，村子中10多個中小學(xué)生就都扛著鋤頭、背上箢子、帶上鐮刀浩浩蕩蕩地到山上找柴，遠山近坡能砍的都被我們砍光，能挖的都被我們挖完，山都變成了光禿禿的。

28S-a：5'ACGTTTGGTTCATCCCACAGC 3'

28S-s：5'CGGTAAAGCGAATGATTAGAGGC 3'

1.2.6 生物軟件

P1：AGGATTYCCYBAGTAGCKGCGAGCGAA；

1.2.7 載體構(gòu)建

利用內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ分別雙酶切具有雙向T7啟動子的載體L4440和28S rDNA目的片段，回收目標(biāo)DNA片段，將純化產(chǎn)物連接，對重組子經(jīng)菌液PCR鑒定，得到陽性克隆，命名為L4440-2828SrDNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆食心蟲28SrDNA基因克隆

從大豆食心蟲基因組模板獲得PCR擴增產(chǎn)物，引物1和引物2的擴增產(chǎn)物為1100 bp（見圖1a），引物3和引物4的擴增產(chǎn)物為1200 bp（見圖1b），并將PCR產(chǎn)物均進行測序，將兩段序列拼接成全長的大豆食心蟲28SrDNA序列，該序列長度為2127 bp。

在推進地下水超采治理試點工作中，始終牢牢把握五條基本原則：一是政府引導(dǎo)、全民行動，發(fā)揮好政府和群眾兩個積極性；二是規(guī)劃統(tǒng)領(lǐng)、科學(xué)治理，年度實施方案與中長期規(guī)劃有機銜接，集中連片規(guī)模實施，務(wù)求治理一片、見效一片、鞏固一片；三是創(chuàng)新機制、示范帶動，探索建立地下水超采治理的有效途徑，力求取得可示范、可復(fù)制、可推廣的經(jīng)驗；四是因地制宜、積極穩(wěn)妥，根據(jù)實際情況，科學(xué)確定治理模式和工程規(guī)模；五是競爭立項、績效考核，依據(jù)項目前期工作和壓采效果擇優(yōu)實施，嚴(yán)格把關(guān)、嚴(yán)格獎懲。

圖1 28SrDNA的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 28SrDNA

將大豆食心蟲28SrDNA序列和其他昆蟲28SrDNA序列進行同源序列比較（見圖2），發(fā)現(xiàn)大豆食心蟲28SrDNA序列與蝎蛉（Anthocharis sara）、大蠟螟（Galleria mellonella）、粉蝶（Panorpa claripennis）、姬蜂（Poecilocryptus nigromaculatu）、家蠶（Bombyx mori）的28SrDNA同源性都在80%以上。采用MEGA4.0軟件利用相鄰連接法NJ（Neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，大豆食心蟲的28SrDNA和鱗翅目家蠶的親緣關(guān)系較近，分布在同一分支，與膜翅目姬蜂親緣關(guān)系較遠，處于不同分支。

圖2 根據(jù)昆蟲28SrDNA序列利用相鄰連接（NJ）法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the sequences of 28SrDNA from insect by neighbor joining method

2.2 大豆食心蟲28SrDNA基因的表達模式分析

為了確定大豆食心蟲28SrDNA基因在大豆食心蟲不同發(fā)育時期和大豆食心蟲幼蟲不同組織的表達情況，利用熒光定量PCR對28SrDNA mRNA的表達情況進行檢測，結(jié)果表明，28SrDNA的rRNA在卵、幼蟲、蛹、成蟲各發(fā)育階段均表達（見圖3），其中成蟲期（AD）28SrDNA的表達量最高，4齡幼蟲（N4）、蛹（PU）和1齡幼蟲(N1)的表達量較高，2齡幼蟲（N2）和3齡幼蟲（N3）表達量較低，卵中表達量最低。28SrDNA在神經(jīng)節(jié)、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個組織中均有表達，其中脂肪體（FT）和睪丸（TE）的相對表達量最高，神經(jīng)節(jié)（SY）的表達量較高，表皮（CU）、唾腺（SA）、中腸（MD）和卵巢（OV）相對表達量較低（見圖4）。

圖3 28SrDNA在大豆食心蟲不同發(fā)育階段的表達量Fig.3 Transcript level of 28SrDNA in different development stage

圖4 28SrDNA在大豆食心蟲不同組織的表達量Fig.4 Transcript level of 28SrDNA in different tissues of soybean pod borer

2.3 構(gòu)建表達dsRNA的重組載體L4440-28SrDNA

利用DNAman軟件將大豆食心蟲28SrDNA和人28SrDNA進行序列比較，選擇同源性最低的大豆食心蟲28SrDNA序列區(qū)域作為目標(biāo)片段。根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計引物，通過PCR擴增得到418 bp的擴增產(chǎn)物（見圖5），純化后克隆到pMD18-T上。將質(zhì)粒pMD18T-28S與載體L4440用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的片段，將純化產(chǎn)物連接，對重組子經(jīng)菌液PCR鑒定，得到陽性克隆，命名為L4440-28SrDNA。重組質(zhì)粒L4440-28SrDNA經(jīng)XbaⅠ單酶切和XbaⅠ、HindⅢ雙酶切（見圖6），目的條帶均與預(yù)期結(jié)果相符，表明構(gòu)建的重組載體L4440-28SrDNA正確。

圖5 28SrDNA目的片段的PCR擴增產(chǎn)物Fig.5 PCR amplification result of 28SrDNA

圖6 重組質(zhì)粒L4440-28SrDNA的雙酶切鑒定Fig.6 Confirmation of recombinant plasmid L4440-28SrDNA by Xba I and Hind III

3 討論

RNA干擾是利用外源導(dǎo)入或轉(zhuǎn)錄載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNA介導(dǎo)受體細胞中的序列特異的同源性mRNA發(fā)生降解或翻譯受阻，引發(fā)受體細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，使與此相應(yīng)的內(nèi)源靶基因的表達被阻抑，從而得到類似于“基因敲除”的基因阻抑效果[12]。Fire等在線蟲發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象后，在真菌、植物、線蟲、昆蟲、斑馬魚、小鼠等大多數(shù)真核生物也發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，研究表明RNAi是生物進化過程中保留下來的一種抵抗微生物侵入、轉(zhuǎn)座子擴展和對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的強大機制。由于RNAi沉默基因的高效性和特異性，將昆蟲關(guān)鍵生長基因dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)細胞，dsRNA介導(dǎo)受體細胞內(nèi)同源性mRNA發(fā)生降解，使昆蟲體內(nèi)與dsRNA相對應(yīng)的靶基因表達被抑制，可以直接分析基因的功能。目前的主要問題是尋找一個向目標(biāo)昆蟲體內(nèi)導(dǎo)入dsRNA簡單而且穩(wěn)定的方法。Timmons等發(fā)現(xiàn)給線蟲喂食表達dsRNA的大腸桿菌或?qū)⒕€蟲浸泡在dsRNA溶液中均能誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)靶基因的沉默，表明dsRNA可以直接從環(huán)境（體內(nèi)腸道和體表）進入到昆蟲體內(nèi)[13]。

目前，國內(nèi)外尚無大豆食心蟲RNA干擾的研究報道。本研究以大豆食心蟲幼蟲作為研究對象，利用同源克隆法克隆大豆食心蟲28SrDNA全長序列。對大豆食心蟲28SrDNA不同發(fā)育階段和不同組織的表達量進行分析，結(jié)果表明，大豆食心蟲28SrDNA在大豆食心蟲的不同發(fā)育階段的不同組織均有表達，在大豆食心蟲生長發(fā)育階段起關(guān)鍵作用。

本研究將28SrDNA的目的片段克隆到L4440載體上，該載體具有雙T7強啟動子，對目標(biāo)基因片段的克隆不要求方向性，目的片段以何種方向連入，利用該載體的雙T7強啟動子均可以得到對應(yīng)于目標(biāo)基因的dsRNA。構(gòu)建完的載體可轉(zhuǎn)入E.coli HT115（DE3）中，該菌株含有T7RNA聚合酶基因，在T7強啟動子的控制下進行該基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生T7RNA聚合酶。而且該菌株還是一個Rnc基因突變菌株，不能編碼降解dsRNA的內(nèi)切酶RnaseⅢ的基因，這樣在IPTG的誘導(dǎo)下，在E.coli HT115菌株中很容易產(chǎn)生大量的目的片段的dsRNA。因此該載體的成功構(gòu)建，為利用喂食方法研究大豆食心蟲28SrDNA基因的功能奠定基礎(chǔ)，有利于進一步探索利用植物介導(dǎo)的RNA技術(shù)防治大豆食心蟲。

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