常 穎，高 垚，李 歡，王歡歡，劉松巖＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長春 130033；2.長春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130051）

近20年來，生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Ω杉?xì)胞的研究一直沒有中斷。胚胎干細(xì)胞由于既受倫理道德宗教的影響；又有導(dǎo)致畸胎瘤發(fā)生的風(fēng)險，因此其研究遇到阻力［1］。神經(jīng)干細(xì)胞的缺陷一是組織來源受限；二是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境決定著移植細(xì)胞的分化方向［2］，因此其基礎(chǔ)及臨床研究也受到限制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）取材容易，能迅速培養(yǎng)、增殖，便于自體移植，且遺傳背景相對穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，彌補(bǔ)了胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞的缺點(diǎn)［3］，但成人骨髓源MSC的數(shù)量及其增殖分化潛能，會隨著人的年齡增加而下降，且病毒感染率較高。由于采集骨髓MSC須對供者行骨髓穿刺術(shù)，因此其來源受到一定限制，難以產(chǎn)業(yè)化。因此羊水干細(xì)胞（amniotic fluid－derived stem cells，AFCs）做為一種新的干細(xì)胞來源，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究從人孕中期羊水（h AFC）中分離、提純、擴(kuò)增羊水干細(xì)胞，并分析其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 主要器材與試劑 Amnio MAX－Ⅱ培養(yǎng)基，α－MEM（Gibco公司）；胎牛血清、HEPES緩沖液（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；熒光素標(biāo)記小鼠抗人CD44、CD45抗體；倒置相差顯微鏡（O－lympus）；YJ－2操凈臺（蘇州凈化設(shè)備廠），CO2孵箱（SANYO日本）

1.2 h AFC的原代培養(yǎng) 10例羊水標(biāo)本來自懷孕16－22周行產(chǎn)前檢查或自愿引產(chǎn)的孕婦，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺取得20 ml羊水。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。羊水標(biāo)本在室溫下1 000／min離心5 min，棄上清，加入Amnio MAX－Ⅱ培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱，出現(xiàn)梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落且達(dá)70%匯合后，0.25%胰蛋白酶1 mmol·L－1EDTA消化后，改用α－MEM＋10%胎牛血清＋4μg／Lb FGF培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，記為第1代（P1）。細(xì)胞生長達(dá)到 融合時按 的比例傳代。原代培養(yǎng)時每天隨機(jī)抽取3個培養(yǎng)孔的AFC作細(xì)胞生長動力學(xué)分析，繪制原代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.3 h AFC的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個培養(yǎng)板的底部，即可用0.25% 胰酶1 mmol·L－1EDT A液消化、分離，然后按3×104／cm2密度傳代接種于6孔培養(yǎng)板中，并記為P1；傳代培養(yǎng)直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個培養(yǎng)板的底面。再重復(fù)以上操作，并記為P2，以此類推，傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)衰老征相。傳代培養(yǎng)的接種密度嚴(yán)格控制在與原代培養(yǎng)接種密度相同的水平以便于對照。每天隨機(jī)抽取3個培養(yǎng)孔的AFC作細(xì)胞生長動力學(xué)分析，繪制傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.4 h AFC細(xì)胞表面分子測定 第10代細(xì)胞80%～90%融合后，用0.25%胰酶1 mmol·L－1EDTA液消化細(xì)胞，制成2×105／ml的單細(xì)胞懸液，分別加入3個Eppendof管中。A管為標(biāo)準(zhǔn)對照，加入5μl IgG1－FITC的單克隆抗體；B管加入5μl CD44－FITC單克隆抗體；C管加入5μl CD45－FITC單克隆抗體，室溫反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 羊水細(xì)胞核型分析 取生長良好的細(xì)胞第10代、20代羊水干細(xì)胞進(jìn)行核型分析。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，培養(yǎng)4 h后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后固定、制片、Gimsa染色后鏡下觀察并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 h AFC的分離、純化、擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)收集的10例孕中期羊水標(biāo)本原代培養(yǎng)成功9例。原代培養(yǎng)4 d可見有細(xì)胞貼壁，平均7 d左右散在的梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落。平均14天左右可達(dá)80%融合（圖1A）。傳代培養(yǎng)后，12 h即可貼壁，細(xì)胞呈較均一的長梭形，7 d左右細(xì)胞可鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面，可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。經(jīng)擴(kuò)增5代后可獲得3×109個細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（圖1B），性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 h AFC原代和傳代培養(yǎng)的生長曲線分析 原代培養(yǎng)細(xì)胞生長潛伏期4－6 d，此期主要為細(xì)胞貼壁生長階段，有絲分裂活動不活躍；第7天倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞形成大小不一的多個細(xì)胞克隆，有絲分裂開始變得活躍；第7－13天，細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大，許多克隆彼此相連，此階段細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)遞增，此期為h AFC原代培養(yǎng)的對數(shù)增殖期；第14～18天，細(xì)胞克隆彼此相連并鋪滿整個培養(yǎng)孔底面，細(xì)胞生長曲線顯示h AFC生長進(jìn)入平臺期；第18天，貼壁生長的h AFC鋪滿整個培養(yǎng)孔底面，原代培養(yǎng)結(jié)束。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞的生長要快些，一般12 h即開始貼壁，多于一周左右即可鋪滿整個培養(yǎng)孔底面。本實(shí)驗(yàn)選擇P5、P15、P20傳代培養(yǎng)的生長曲線（見圖2）進(jìn)行觀察比較，發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)具有以下共性特征：傳代培養(yǎng)的生長潛伏期1－2 d，對數(shù)增長期3－6 d，生長平臺期7－10 d。傳代培養(yǎng)細(xì)胞在P25代以后開始出現(xiàn)衰老征相。

2.3 h AFC表型 h MSC均一表達(dá)CD44，但CD45陰性（見圖3）。

2.4 第10代、20代羊水干細(xì)胞檢測干細(xì)胞核型正常，為46XX和46XY。

3 討論

羊水干細(xì)胞做為一種新的干細(xì)胞來源，最早是在2003年被 Prusa［4］等發(fā)現(xiàn)；2007年，Paolo［5］等將由羊水中分離獲得的干細(xì)胞命名為羊水干細(xì)胞（AFC），這種細(xì)胞表達(dá) MSC（Mesenchymal stem cell）、不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記，90%的細(xì)胞表達(dá)Oct－4；這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了羊水干細(xì)胞研究的熱潮，羊水干細(xì)胞有望成為新的干細(xì)胞種子來源，應(yīng)用于細(xì)胞及基因治療。目前對干細(xì)胞的體外分離純化技術(shù)大多建立在對細(xì)胞表面標(biāo)記識別的基礎(chǔ)之上，具體的方法有流式細(xì)胞分離法、免疫磁珠分選法；另外還有依據(jù)分選細(xì)胞的物理性質(zhì)所采用的梯度離心法和組織消化法；還有也可運(yùn)用特定的培養(yǎng)基的選擇作用和機(jī)械分離方法分離純化干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)即采用羊水專用培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司 Aminio MAX－Ⅱcomplete培養(yǎng)基，結(jié)合機(jī)械分離方法從羊水中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。

hFSC原代細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線顯示，h FSC在體外培養(yǎng)條件下的生長與其他細(xì)胞一樣經(jīng)歷了生長滯緩期、對數(shù)增殖期、生長平臺期。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般4 d左右細(xì)胞開始貼壁，并形成散在的細(xì)胞集落。細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶需大約2周（14 d）的時間。h FSC傳代細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線顯示，細(xì)胞生長的潛伏期縮短，一般4 h即開始貼壁，12 h完全貼壁，1周左右即可長滿整個培養(yǎng)瓶。經(jīng)擴(kuò)增5代后可獲得3×109個細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定，傳代到第20代細(xì)胞核型仍保持正常。因此，通過離體培養(yǎng)，使羊水中低峰度的MSC在體外實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增是可行的。羊水干細(xì)胞的這些特性使其成為組織工程中進(jìn)行細(xì)胞治療的理想的種子細(xì)胞，有很大的臨床應(yīng)用前景。經(jīng)歷了25代傳代培養(yǎng)，h FSC開始出現(xiàn)衰老征相：即細(xì)胞生長速度緩慢，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂和從培養(yǎng)板底脫落等。此結(jié)果和Kim［6］等的研究結(jié)果一致。

雖然目前國內(nèi)外的科學(xué)家都致力于羊水干細(xì)胞的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)AFC特征性的表面標(biāo)記。AFC在細(xì)胞表型上類似于胚胎干細(xì)胞和成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，即SH2、CD44和CD90陽性，CD34、CD45和CD117 HLADR陰性［7］；在AFSC表面標(biāo)記中引人注意的是POU轉(zhuǎn)錄因子4（Oct－4）等胚胎特異性標(biāo)記的表達(dá)［8］，提示羊水中存在比間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育更原始、增殖和分化能力更強(qiáng)、更接近于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD45，因此證明我們培養(yǎng)的羊水細(xì)胞是具有MSC特性的干細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)對孕中期羊水來源的干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為羊水干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)提供了簡便易行的操作方法。但此研究還只處于初級階段，進(jìn)一步的深入研究羊水干細(xì)胞的生物學(xué)特性對應(yīng)用于基因疾病的臨床治療具有重要意義。

圖2 原代、傳代hFSC生長曲線

圖3 hFSC細(xì)胞表型

［1］Thomson JA，Kalishman J，Golos TG，et al.Isolation of a primate embryonic stem cell line［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1995，92：7844.

［2］Bjorklund A，Lindvall O.Cell replacement for central nervous system disorders.Nature［J］.Neurosci，2000，3：537.

［3］Jaiswal N，Haynesworth SE，Caplan AI，et al.Osteogenic differentiation of purified，culture－expanded human mesenchymal stem cells in vivo［J］.J Cell Biochem，1997，64（2）：295.

［4］Prusa AR，Marton E，Rosner M，et al.Oct－4 expressing cells in human amniotic fluid：a new source for stem cell research［J］？Hum Reprud，2003，18（7）：1489.

［5］Paolo DC，Georg B，Minhaj S，Tao X，et al.Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy［J］.Nature Biotechnology，2007，25（1）：100.

［6］Kim J，Lee Y，You J，et al.Human amniotic fluid－derived stem cells have characteristics of multi otent stem cells［J］.Cell Pro lif，2007，40（1）：75.

［7］Sartore S，Maddalena L，Annalisa A，et al.Amniotic mesenchymal cells autotransplanted in a porcine model of cardiac ischemia do not differentiate to cardiogenic phenotypes［J］.Europ J Card Surg 2005，28：677.

［8］Bossolasco P，Montemurro T，Cova L.et al.Molecular and phenotypic characterization of human amniotic fluid cells and their differentiation potential［J］.Cell Res，2006；16（4）：329.