丁嵩濤 彭惠民 周宇箭 劉含登

重慶醫(yī)科大學(xué)實驗教學(xué)中心，重慶 401331

腫瘤是威脅人類健康的一大疾病，手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療方法對中晚期及轉(zhuǎn)移性腫瘤療效較差。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療已經(jīng)運用于臨床，然而腫瘤是一種多基因疾病，運用單一基因進(jìn)行治療往往達(dá)不到預(yù)期效果。因此同時運用多種基因聯(lián)合治療，基因治療聯(lián)合放療化療治療腫瘤疾病成為近年來研究的熱點[1]。

白細(xì)胞介素24（IL-24）屬于白介素10（IL-10）細(xì)胞因子家族。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，并且對正常細(xì)胞沒有明顯毒副作用[2]。PTEN是一種抑癌基因，其缺失與突變和腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)PTEN能夠引起腫瘤細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞生長和遷移[3]。

本實驗通過將IL-24和張力蛋白同源基因（PTEN）兩種不同作用途徑的抑癌基因使用pIRES質(zhì)粒構(gòu)建雙基因共表達(dá)載體，將重組共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-IL-24-PTEN轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，觀察IL-24和PTEN表達(dá)情況，從而為探討上述兩種基因聯(lián)合治療腫瘤疾病的可能性及進(jìn)一步研究其信號通路及抗癌機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

限制性內(nèi)切酶（Nhe Ⅰ，MluⅠ，XbaⅠ，NotⅠ），T4 DNA連接酶，DL2000 marker，pMD18-T載體，PCR試劑盒購自TAKARA公司，膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，引物由上海生物工程公司合成，pIRES載體購自Clontech公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，小鼠抗人PTEN抗體和兔抗人IL-24抗體及HRP標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz公司，大腸桿菌DH5α，A549細(xì)胞，pGEX-IL-24質(zhì)粒和pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒為本室保存。

1.2 PCR擴(kuò)增IL-24和PTEN基因片段

通過PCR方法從pGEX-IL-24質(zhì)粒和pcDNA3.1-PTEN質(zhì)粒擴(kuò)增帶有NheⅠ和MluⅠ酶切位點的IL-24片段以及帶有XbaⅠ和NotⅠ酶切位點的PTEN片段，根據(jù)IL-24和PTEN報道序列設(shè)計引物，引物為：IL-24sense：5’-CGGCTAGC ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA-3’ IL-24antisense：5’-CGACGCGTTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’ PTENsense：5’-GCTCTAGACATGACAGCCATCATCAAAGAG-3’PTENantisense：5’-GTGCGGCCGCTTCAGACTTTTGTAATTTGTGT-3’ （劃線部分為NheⅠ，MluⅠ，XbaⅠ，NotⅠ的酶切位點），反應(yīng)體系：模板 2μL，10×Buffer2μL，dNTPs0.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.25μL，滅菌水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s（IL-24退火溫度：59℃；PTEN退火溫度：55℃），72℃延伸1 min，經(jīng)過30次循環(huán)后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收純化后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定并送測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-IL-24和pMD18-PTEN。

1.3 構(gòu)建pIRES-IL-24-PTEN載體

NheⅠ和MluⅠ雙酶切pMD18-IL-24質(zhì)粒和pIRES質(zhì)粒，膠回收試劑盒分別回收目的片段，使用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取陽性菌株進(jìn)行酶切鑒定。鑒定正確的菌株提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，同時pMD18-PTEN質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ，NotⅠ雙酶切，膠回收目的片段，使用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送測序，測序正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測OD260和OD280值，檢測質(zhì)粒純度，同時檢測質(zhì)粒濃度。

1.4 A549細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇的A549細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37℃、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，傳2代后將細(xì)胞以0.6×105個/孔傳代于24孔板，使用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到90%~95%融合，按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，質(zhì)粒與脂體按1︰2.5比例轉(zhuǎn)染。

1.5 IL-24和PTEN的表達(dá)和檢測

轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后使用Tank法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入小鼠抗人PTEN抗體和兔抗人IL-24抗體，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 IL-24和PTEN基因片段的擴(kuò)增

以pGEX-IL-24質(zhì)粒和pcDNA3.1-PTEN質(zhì)粒為模板，用引入雙酶切位點的IL-24引物和PTEN引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約640 bp和1 200 bp處分別得到清晰條帶，與IL-24和PTEN基因大小相符。見圖1。

M：DNA marker（DL2000）；1：IL-24 PCR產(chǎn)物；2：PTEN PCR 產(chǎn)物圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析IL-24和PTEN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 pIRES-IL-24-PTEN載體的構(gòu)建

pIRES載體連接上IL-24和PTEN基因片段后分別進(jìn)行NheⅠ，MluⅠ雙酶切和XbaⅠ，NotⅠ雙酶切鑒定，在約640bp處和1 200 bp處得到清晰條帶，證明IL-24和PTEN基因片段已連接入載體，pIRES-IL-24-PTEN載體構(gòu)建成功。見圖2。

M：DNA marker（λ-EcoT14 I）；1：pIRES-IL-24-PTEN經(jīng)Xba I和Not I雙酶切；2：pIRES-IL-24-PTEN經(jīng)Nhe I和Mlu I雙酶切圖2 pIRES-IL-24-PTEN酶切電泳鑒定結(jié)果

2.3 Western blot檢測IL-24和PTEN蛋白的表達(dá)

pIRES-IL-24-PTEN載體轉(zhuǎn)染A549人肺癌細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果可見轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組出現(xiàn)IL-24和PTEN特異性條帶和β-actin條帶，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組未出現(xiàn)IL-24和PTEN條帶，只有β-actin條帶出現(xiàn)，證明轉(zhuǎn)染pIRES-IL-24-PTEN的A549細(xì)胞有IL-24和PTEN蛋白表達(dá)。見圖3。

1：未轉(zhuǎn)染pIRES-IL-24-PTEN載體；2：轉(zhuǎn)染pIRES-IL-24-PTEN載體圖3 Western blot法鑒定IL-24和PTEN基因在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

IL-24又名黑色素瘤分化相關(guān)基因7，具有多種生物學(xué)活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其快速凋亡，抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，并具有免疫調(diào)節(jié)功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24通過多種信號通路特異誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中包括：通過激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（PKR）信號途徑，激活其下游因子eIF2α，Tyk2，p38MAPK，阻止細(xì)胞內(nèi)蛋白合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘發(fā)凋亡[5]；與BiP/GRP78結(jié)合，誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response），激活p38 MAPK信號通路，上調(diào)GADD基因表達(dá)[6]；通過改變促凋亡蛋白（Bax，Bad，Bak和 Bcl-xS）和抗凋亡蛋白（Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-W，Mcl-1）的比例誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。

PTEN是一種腫瘤抑制因子，其突變和缺失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8]。細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)的PTEN具有抗腫瘤活性，可以通過拮抗PI3K-PKB/AKT信號途徑，抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡[9]；同時還可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移并抑制腫瘤血管新生[10]。除此之外，PTEN還具有多種重要的生物學(xué)功能，如：PTEN可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，說明其具有抑制細(xì)胞生長的功能[11]；細(xì)胞核中PTEN主要維持基因組穩(wěn)定并與染色質(zhì)功能相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)PTEN定位于著絲粒并與著絲粒蛋白C相結(jié)合，從而保持染色體的完整[12]。cDNA微陣列探針研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因突變的細(xì)胞會發(fā)生廣泛的基因表達(dá)譜改變，說明PTEN可能參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[13]。

進(jìn)一步的cDNA微陣列探針研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中由腺病毒介導(dǎo)表達(dá)IL-24可引起腫瘤抑制基因PTEN表達(dá)增加并抑制PI3K信號途徑，說明IL-24和PTEN在信號通路上有關(guān)聯(lián)[14]，還需要進(jìn)一步研究以揭示以上兩種抑癌基因的信號通路及相互作用。

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）來源于病毒和真核細(xì)胞mRNA 的5’端非翻譯區(qū)，具有不依賴于5’帽子結(jié)構(gòu)而募集核糖體并啟動下游基因翻譯的功能[15]。運用IRES構(gòu)建雙基因或多基因表達(dá)載體可以同時研究多種基因的相互作用及功能。本實驗運用含有IRES位點的pIRES載體成功構(gòu)建了pIRES-IL-24-PTEN雙表達(dá)載體，可用于聯(lián)合表達(dá)IL-24和PTEN基因，為進(jìn)一步研究其協(xié)同抗癌作用及抗癌機(jī)理提供了實驗基礎(chǔ)。

[1] Reed JC.Apoptosis-regulating proteins as targets for drug discovery[J].Trends Mol Med，2001，7（7）：314-319.

[2] Pestka S，Krause CD，Sarkar D，et al.Interleukin-10 and related cytokines and receptors[J].Annu Rev Immunol，2004，22：929-979.

[3] Weng L，Brown J，Eng C.PTEN induces apoptosis and cell cycle arrest through phosphoinositol-3-kinase/Akt-dependent and independent pathways[J].Hum Mol Genet，2001，10（3）：237-242.

[4] Ramesh R，Ito I，Gopalan B，et al.Ectopic production of MDA-7/IL-24 inhibits invasion and migration of human lung cancer cells.[J].Mol Ther，2004，9（4）：510-518.

[5] Pataer A，Vorburger SA，Barber GN，et al.Adenoviral transfer of the melanoma differentiation-associated gene 7 （mda7） induces apoptosis of lung cancer cells via up-regulation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase（PKR）[J].Cancer Res，2002，62（8）：2239-2243.

[6] Gupta P，Walter MR，Su ZZ，et al.BiP/GRP78 is an intracellular target for MDA-7/IL-24 induction of cancer-specific apoptosis[J].Cancer Res，2006，66（16）：8182-8191.

[7] Lebedeva IV，Sarkar D，Su ZZ，et al.Bcl-2 and Bcl-x（L） differentially protect human prostate cancer cells from induction of apoptosis by melanoma differentiation associated gene-7，mda-7/IL-24 [J].Oncogene， 2003，22（54）：8758-8773.

[8] Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN， a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain， breast，and prostate cancer[J].Science，1997，275（5308）：1943-1947.

[9] Weng L，Brown J，Eng C.PTEN induces apoptosis and cell cycle arrest through phosphoinositol-3-kinase/Akt-dependent and –independent pathways[J].Hum Mol Genet，2001，10（3）：237-242.

[10] Salmena I，Carracedo A，Pandolfi PP.Tenets of PTEN tumor suppression[J].Cell，2008，133（3）：403-414.

[11] Ginn-Pease ME，Eng C.Increased nuclear phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 is associated with G0-G1 in MCF-7 cells[J].Cancer Res，2003，63（2）：282-286.

[12] Shen WH，Balajee AS，Wang J，et al.Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity[J]. Cell，2007，128（1）：157-170.

[13] Matsushima-Nishiu M，Unoki M，Ono K，et al.Growth and gene expression profile analyses of endometrial cancer cells expressing exogenous PTEN[J].Cancer Res，2001，61（9）：3741-3749.

[14] Mhashilkar AM，Stewart AL，Sieger K，et al.MDA-7 negatively regulates the beta-catenin and PI3K signaling pathways in breast and lung tumor cells[J].Mol Ther，2003，8（2）：207-219.

[15] Vagner S，Galy B，Pymnnet S.Irresistible IRES Attracting the translation machinery to intemal ribosome entry sites[J].EMBO Rep，2001，2（10）：893-898.