劉文婷，段琦梅，劉景玲，孫延芳

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

2 遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 阜新 123000

苜蓿Medicago sativa L. 是世界上分布最廣泛的一種豆科多年生牧草，素有“牧草之王”的美譽(yù)，是目前國內(nèi)外最重要的豆科牧草[1]。苜蓿在土壤保持和固氮方面也有重要的作用[2]。在過去幾年中，許多研究已經(jīng)探討了使用農(nóng)桿菌的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化[3-9]。但是，轉(zhuǎn)化方法仍有很大的局限性，比如轉(zhuǎn)化效率低、基因型依賴性、轉(zhuǎn)化程序復(fù)雜和轉(zhuǎn)化時(shí)間長、玻璃化植株比例高[3,5-7,9-11]。因此，優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法有助于苜蓿轉(zhuǎn)基因的廣泛應(yīng)用。

先前的研究已經(jīng)探索了不同類型外植體能提供苜蓿轉(zhuǎn)化優(yōu)化的可能性，也提供了多基因轉(zhuǎn)化到苜蓿植株的可行性。在裸子植物和一些谷類作物中已經(jīng)使用了體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法[12-14]，結(jié)果表明，使用體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化方法具有很大的優(yōu)勢(shì)，轉(zhuǎn)化效率高、減少逃逸和轉(zhuǎn)化程序快[13,15-16]。苜蓿在體細(xì)胞胚再生研究中是模式植物[17-19]。但是，很少有研究使用苜蓿體細(xì)胞胚作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。Ninkovic等[20]做了使用體細(xì)胞胚的苜蓿轉(zhuǎn)化研究，但是，在研究中沒有提供Southern雜交數(shù)據(jù)，不能從分子水平證實(shí)使用體細(xì)胞胚進(jìn)行苜蓿轉(zhuǎn)化方法的可行性。

本研究中，我們使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法，試驗(yàn)證明此方法速度快、且簡單易行，為多基因在同一受體的共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)苜蓿優(yōu)良性狀改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

按照Tian等[21]的方法，使用葉柄外植體誘導(dǎo)初級(jí)體細(xì)胞胚：選取生長60~90 d的野生型苜蓿無菌苗的葉柄作為外植體，用解剖刀切成8 mm長的小段，置于SH2K愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20 d繼代1次，形成的愈傷組織轉(zhuǎn)到胚形成培養(yǎng)基BOi2Y中21 d后，體細(xì)胞胚形成，選取子葉期的初級(jí)體細(xì)胞胚用作外植體來誘導(dǎo)次級(jí)體細(xì)胞胚。典型的初級(jí)體細(xì)胞胚如圖 1A所示。

1.1.2 培養(yǎng)基

SH2K培養(yǎng)基：用于誘導(dǎo)愈傷組織。主要成分見文獻(xiàn)[22-23]：1 mg/L 2，4-D、0.2 mg/L Kinetin生長調(diào)節(jié)劑，4.35 g/L硫酸鉀，288 mg/L脯氨酸，53 mg/L硫代脯氨酸，200 mg/L肌醇，30 g/L蔗糖，2.5 g/L植物膠 (pH 5.8)。

BOi2Y培養(yǎng)基：用于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成。主要成分見文獻(xiàn)[24]：0.2%酵母提取物，100 mg/L肌醇，30 g/L蔗糖，2.5 g/L的植物膠(pH 5.9)。

MSO培養(yǎng)基：用于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的萌發(fā)。主要成分見文獻(xiàn)[25]：4.3 g/L MS鹽，1 mg/L氨基乙酸，40 g/L蔗糖，8 g/L的瓊脂 (pH 5.8)。

圖1 初級(jí)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和次級(jí)體細(xì)胞胚的形成Fig. 1 Induction of primary somatic embryos (SE) and development of secondary SE. (A) Primary mid-cotyledonary stage SE used for explants. (B) Calli formed at the cut surface of the explants after 3 weeks of culture in SH2K medium. (C) Secondary SE formed after 4 weeks of culture in BOi2Y medium. (D) Globular embryos were observed in BOi2Y medium. (E) Heart embryos were observed in BOi2Y medium. (F) Torpedo embryos were observed in BOi2Ymedium. (G) Pre-cotyledon embryos were observed in MSO medium. (H) Embryos germination, root and leaf development.

1/2 MSO培養(yǎng)基：用于誘導(dǎo)植株的形成。主要成分見文獻(xiàn)[25]：2.65 g/L MS鹽，1 mg /L氨基乙酸，20 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂 (pH 5.8)。

1.1.3 農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒

試驗(yàn)用農(nóng)桿菌菌株為GV3101[26]，表達(dá)載體為pCambia2301 (圖2)，pCambia2301質(zhì)粒由加拿大南方作物與食品保護(hù)中心田立寧實(shí)驗(yàn)室提供。其包含β-葡萄糖苷酶報(bào)告基因 (gus) 和抗性篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (nptⅡ)，這 2個(gè)基因均受CaMV 35s啟動(dòng)子調(diào)控，其中g(shù)us基因包含一個(gè)內(nèi)含子，其可消除殘余菌液中的 gus基因表達(dá)行為。pCambia2301載體通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌 GV3101菌株[27]。該載體T-DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)見圖2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)N4.4.2苜蓿次級(jí)體細(xì)胞胚形成的影響

SH2K[22-23]和 B5h[28]用于誘導(dǎo)來自初級(jí)體細(xì)胞胚的胚性愈傷。初級(jí)體細(xì)胞胚放在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織形成，21 d后在新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代，形成好的愈傷組織轉(zhuǎn)到胚形成培養(yǎng)基BOi2Y中，14 d后體細(xì)胞胚形成。

1.2.2 不同苜?；蛐蛯?duì)次級(jí)體細(xì)胞胚的影響

N4.4.2、XAK-6A-10、F1-1和XAK-6A-7四個(gè)苜?；蛐陀糜谘芯坎煌蛐蛯?duì)次級(jí)體細(xì)胞胚的影響。

圖2 表達(dá)載體pCambia2301的T-DNA結(jié)構(gòu)Fig. 2 Schematic representation of the T-DNA (5.3 kb) of pCambia2301.

1.2.3 體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化和植株的恢復(fù)

選取子葉期的體細(xì)胞胚作為外植體，用解剖刀切開，置于SH2K培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d。將?20 ℃下保存的農(nóng)桿菌在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)1~2 d，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期后，測(cè)定農(nóng)桿菌菌液OD600為0.5~1.0時(shí)，用農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)的外植體4 min，用無菌濾紙吸去多余菌液，轉(zhuǎn)移外植體至含20 μmol/L乙酰丁香酮的SH2K培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2 d，預(yù)培養(yǎng)和乙酰丁香酮用于提高轉(zhuǎn)化效率[29]。隨后，在含75 mg/L卡那霉素的SH2K愈傷形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選抗性愈傷。繼代培養(yǎng)2~3次后，將生長旺盛、外觀黃綠色、疏松的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含 75 mg/L卡那霉素的BOi2Y胚形成培養(yǎng)基上，14 d后，新鮮的胚狀愈傷組織上出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，30 d后體細(xì)胞胚形成。將再生的綠色體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到含75 mg/L卡那霉素的MSO[25]胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，28 d后體細(xì)胞胚生根萌芽，根和葉形成。將形成的植株再轉(zhuǎn)到含有75 mg/L卡那霉素的1/2 MSO植株形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后選擇根系生長健壯、株高約10 cm的植株移栽于溫室中或用于轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。所有的培養(yǎng)均在25 ℃、24 h光周期、3 000 lx光照條件下進(jìn)行。每一步的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)都是在75 mg/L的卡那霉素篩選壓下進(jìn)行。

1.2.4 GUS組織化學(xué)定位和熒光檢測(cè)

轉(zhuǎn)化植株形成后，取苜蓿植株各組織，用于GUS組織定位分析和熒光定量檢測(cè)分析[30]，通過組織化學(xué)分析確定 GUS表達(dá)的穩(wěn)定性。將植物組織浸沒在含有5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-葡萄糖苷 (X-Gluc) 溶液的 2 mL Eppendorf管中，X-Gluc 溶液中含：0.5 mmol/L鐵氰化鉀、0.5 mmol/L亞鐵氰化鉀、體積分?jǐn)?shù)0.3% Triton X-100、1 g/L X-Gluc和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，37 ℃保溫過夜。第2天將植物組織用不同梯度的酒精脫色，在顯微鏡下觀察組織染色情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)

從轉(zhuǎn)化植株中，隨機(jī)選擇11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，按照Lodhi等[31]的方法，分別取幼嫩的植物葉片0.5 g提取基因組DNA。

采用 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)目的片段，以pCAMBIA2301載體上的gus和npⅡ基因序列為參考，設(shè)計(jì)二者的上、下游引物，其中g(shù)us正向引物為5￠-CGTCCTGTAGAAACCCCAAC-3￠，gus反向引物為5￠-ATTGACCCACATTTGCCGT-3￠，npⅡ正 向 引 物 為 5￠-GAGGCTATTCGGC TATGACTG-3￠，nptⅡ反向引物為 5￠-ATCGG GAGCGGCGATACCGTA-3￠。gus和nptⅡ基因的預(yù)期片段長度分別為300 bp和700 bp，引物由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括100 ng DNA，200 μmol/L dNTPs，1 μmol/L的上、下引物，1 U Taq DNA聚合酶，1.5 mmol/L MgCl2，5 μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

Southern blotting檢測(cè)中，提取轉(zhuǎn)基因苜蓿的基因組 DNA，采用紫外分光光度法結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定DNA純度和濃度。將10 μg DNA樣品以T-DNA中邊界具有單切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切過夜，在40 V電壓下，電泳8~10 h，凝膠經(jīng)變性與中和后，轉(zhuǎn)膜和紫外交聯(lián)固定DNA之后與地高辛標(biāo)記的nptⅡ探針雜交，雜交操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[32]并稍加改進(jìn)。

1.2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003軟件，并使用SAS 8.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行最小顯著性檢驗(yàn)(LSD，P≤0.05)，數(shù)據(jù)用“平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析 (One way Anova)。所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)苜蓿次級(jí)體細(xì)胞胚的影響

圖1C是誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無生長調(diào)節(jié)劑的 BOi2Y培養(yǎng)基后，形成的次級(jí)體細(xì)胞胚。在愈傷誘導(dǎo)SH2K培養(yǎng)基中，次級(jí)體細(xì)胞胚的響應(yīng)率是 89.29%，而在 B5h培養(yǎng)基的響應(yīng)率是63.32% (表1)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，體細(xì)胞胚在不同培養(yǎng)基中存在顯著差異，次級(jí)體細(xì)胞胚的響應(yīng)率在SH2K培養(yǎng)基中明顯高于在B5h培養(yǎng)基中。另外，對(duì)于響應(yīng)的體細(xì)胞胚來說，在SH2K培養(yǎng)基中，每個(gè)初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚數(shù)目7.00±0.94，而在B5h培養(yǎng)基中，每個(gè)初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚數(shù)目是3.27±0.75，方差分析表明，在不同培養(yǎng)基中每個(gè)初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚存在顯著差異 (P<0.05) (表1)。

2.2 不同苜?；蛐蛯?duì)次級(jí)體細(xì)胞胚的影響

從2.1中得出SH2K培養(yǎng)基是苜蓿次級(jí)體細(xì)胞培養(yǎng)最優(yōu)化的培養(yǎng)基，因此，將 4個(gè)苜蓿基因型N4.4.2、XAK-6A-10、F1-1和 XAK-6A-7的初級(jí)體細(xì)胞胚置于 SH2K培養(yǎng)基中誘導(dǎo)次級(jí)體細(xì)胞胚。100 mg的胚性愈傷組織產(chǎn)生的體細(xì)胞胚的數(shù)目，在 N4.4.2、XAK-6A-10、F1-1中沒有差異，而XAK-6A-7最低。4個(gè)基因型中，初級(jí)體細(xì)胞胚產(chǎn)生的次級(jí)體細(xì)胞胚存在明顯的差異，基因型N4.4.2初級(jí)體細(xì)胞胚產(chǎn)生次級(jí)體細(xì)胞胚的響應(yīng)率為89.29%，而AK-6A-10、F1-1、XAK-6A-7三個(gè)基因型分別為54.55%、38.18%、38.10%，N4.4.2與其余3個(gè)基因型之間有明顯的差異。不同基因型次級(jí)體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化成植株的轉(zhuǎn)化效率也有顯著性差異 (P<0.05)，N4.4.2的轉(zhuǎn)化效率為 (7.84±1.62) %，顯著高于其他3個(gè)基因型 (表2)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)苜?；蛐蚇4.4.2次級(jí)體細(xì)胞胚形成的影響Table 1 Effect of different media on the development of alfalfa N4.4.2 genetype secondary somatic embryos

表2 不同苜蓿基因型對(duì)次級(jí)體細(xì)胞的的影響Table 2 Effect of different alfalfa genetype on the development of secondary somatic embryos

2.3 N4.4.2次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植株的組織化學(xué)定位分析

從2.1和2.2得出，SH2K培養(yǎng)基是次級(jí)體細(xì)胞胚優(yōu)化培養(yǎng)基，N4.4.2苜?；蛐褪亲罴鸦蛐汀Ｒ虼?，SH2K培養(yǎng)基和N4.4.2苜蓿的初級(jí)體細(xì)胞胚用于苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。用農(nóng)桿菌侵染N4.4.2苜蓿的初級(jí)體細(xì)胞胚，在含有卡那霉素篩選的SH2K培養(yǎng)基中連續(xù)繼代2~3次后，在外植體表面形成愈傷組織 (圖 1B)。隨后愈傷組織轉(zhuǎn)到胚形成培養(yǎng)基BOi2Y中，14 d后次級(jí)體細(xì)胞胚形成，不同時(shí)期的體細(xì)胞胚包括球形胚 (圖1D)、心形胚 (圖1E)、水雷胚 (圖1F)、子葉胚 (圖1G)。形成的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)到植株形成培養(yǎng)基MSO中，20 d后，次級(jí)體細(xì)胞胚萌發(fā)，胚軸、葉和根延伸生長，轉(zhuǎn)化苜蓿植株形成。隨后，轉(zhuǎn)化植株移栽至溫室 (圖 3C)。通過組織化學(xué)定位分析不同組織的GUS表達(dá)，愈傷組織 (圖3A)、體細(xì)胞胚 (圖3B)、葉 (圖3D)、根 (圖3E)、花 (圖3F)不同組織中均有GUS表達(dá)。在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，從供試的237個(gè)來自不同初級(jí)體細(xì)胞胚中，獲得了36個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，共156個(gè)轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。轉(zhuǎn)化效率是65.82% (表3)。

2.4 轉(zhuǎn)化植株的PCR分析和Southern雜交分析

用 PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化苜蓿植株，以轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株葉片的DNA為模板，使用gus和nptII基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，轉(zhuǎn)化苜蓿植株中分別可以檢測(cè)到300 bp和700 bp的 DNA擴(kuò)增片段，而未轉(zhuǎn)化的野生型苜蓿植株中沒有DNA擴(kuò)增片段 (圖4)。

同時(shí)，提取轉(zhuǎn)化植株葉片中的基因組DNA，用EcoR Ⅰ酶酶切基因組DNA。由于EcoR Ⅰ酶在T-DNA區(qū)有單一酶切位點(diǎn)，因此，用EcoR Ⅰ酶酶切、nptⅡ基因作為探針雜交，每一個(gè)雜交帶可以看作獨(dú)立整合位點(diǎn)[33]，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出不同整合情況，整合 nptⅡ基因的不同拷貝數(shù) 1~4 (圖5)，Southern雜交證實(shí)了nptⅡ基因已經(jīng)整合到植物基因組。

圖3 轉(zhuǎn)基因苜蓿的形成和GUS在不同轉(zhuǎn)基因植物中的組織化學(xué)定位分析Fig. 3 Development of transgenic alfalfa plants and GUS expression in different tissue by histochemical analysis. (A) GUS expression in calli from primary somatic embryos infected by Agrobacterium strain GV3101. (B) GUS expression in secondary somatic embryos. (C) Transgenic alfalfa plant in greenhouse. (D) GUS expression in leaf from recovered transgenic alfalfa plants. (E) GUS expression in root from recovered transgenic alfalfa plants. (F) GUS expression in inflorescence from recovered transgenic alfalfa plants.

表3 N4.4.2基因型苜蓿次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化Table 3 Genetic transformation of alfalfa N4.4.2 genetype secondary somatic embryos

圖4 轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的苜蓿植株中GUS和nptII基因的PCR檢測(cè)Fig. 4 PCR analysis of GUS and nptII gene in transformed and non-transformed alfalfa. M: Marker DNA; 1: non-transformed control plant; 2?12: transformed plants.

圖5 Southern雜交分析轉(zhuǎn)基因植株nptⅡ基因的拷貝數(shù)Fig. 5 Southern blotting analysis of transgenic plants to detect the copy number of npt Ⅱgene. M: molecular weight marker; 1–5: transgenic plants; 6: non-transgenic control plant.

3 討論

優(yōu)良品種選育是苜蓿優(yōu)質(zhì)飼草高產(chǎn)的基礎(chǔ)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為苜蓿優(yōu)良品種選育開辟了一條新的途徑。苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系又是其轉(zhuǎn)基因的重要前提與基礎(chǔ)，它的再生體系主要是通過體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑來實(shí)現(xiàn)。該途徑有很多優(yōu)點(diǎn)，諸如體細(xì)胞胚具有在實(shí)驗(yàn)室條件下容易獲得，并且轉(zhuǎn)化率較高；容易得到大量的轉(zhuǎn)化植株，便于后代的篩選。

本研究參照 Tian等[21]的方法，選擇不同苜?；蛐秃团囵B(yǎng)基，利用苜蓿初級(jí)體細(xì)胞胚為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，建立并優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。研究表明，從胚性愈傷組織到體細(xì)胞胚的形成通常需要不同的培養(yǎng)基[34-35]。在本試驗(yàn)中，首先在含有生長調(diào)節(jié)劑的SH2K和B5h培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚性愈傷組織，然后，轉(zhuǎn)移愈傷組織到無生長調(diào)節(jié)劑的胚形成培養(yǎng)基 BOi2Y中，誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚。在這2種培養(yǎng)基中，我們觀察到來自初級(jí)體細(xì)胞胚形成的愈傷組織是非?？焖俚?，大量的愈傷組織的形成僅需要7 d時(shí)間。而來自葉柄、莖、葉外植體和別的類型的外植體愈傷組織的形成需要20 d[21]。同時(shí)，在這2種培養(yǎng)基中，初級(jí)體細(xì)胞胚在SH2K培養(yǎng)基中愈傷組織響應(yīng)率是89.29%，誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚的數(shù)目是 (7.00±0.94) 個(gè)，明顯優(yōu)于B5h培養(yǎng)基。也就是說，單個(gè)初級(jí)體細(xì)胞胚通過SH2K培養(yǎng)基誘導(dǎo)次級(jí)體細(xì)胞胚數(shù)目達(dá)到了7個(gè)，在B5h培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚的數(shù)目只達(dá)到了3個(gè)。而且，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，來自畸形的初級(jí)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)形成的次級(jí)體細(xì)胞胚是正常的。這說明初級(jí)體細(xì)胞胚作為外植體在SH2K培養(yǎng)基中大大提高了次級(jí)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)頻率。

植物的基因型也是影響苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的重要因素。在本試驗(yàn)中，4個(gè)苜?；蛐蚇4.4.2、XAK-6A-10、F1-1和XAK-6A-7置于優(yōu)化的SH2K培養(yǎng)基中誘導(dǎo)次級(jí)體細(xì)胞胚，結(jié)果表明，N4.4.2與其他3個(gè)苜蓿基因型誘導(dǎo)的次級(jí)體細(xì)胞胚的響應(yīng)率和次級(jí)體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化成植株的轉(zhuǎn)化率存在顯著差異，N4.4.2是4個(gè)基因型中最優(yōu)化的基因型。因此，苜蓿農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)注意選擇合適的基因型。這與先前的研究是一致的[3,6,9-10]。

N4.4.2基因型和SH2K培養(yǎng)基是本研究的優(yōu)化基因型和培養(yǎng)基，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。組織化學(xué)定位、PCR和Southern雜交檢測(cè)表明，gus基因已經(jīng)整合入苜蓿基因組中并得到正確的轉(zhuǎn)錄。從供試的237不同初級(jí)體細(xì)胞胚中，共獲得36個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，156個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)化效率是 65.82%。次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法提高了苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化效率。

目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)化技術(shù)只是將單個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化用于植物的改良。但是，在植物體內(nèi)，代謝途徑或數(shù)量性狀的遺傳修飾常常需要多個(gè)相關(guān)基因協(xié)同表達(dá)，因此，將相關(guān)多基因轉(zhuǎn)化到同一植株中，就顯得很有必要。本研究首次報(bào)道了苜蓿次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化。在今后的試驗(yàn)中，我們?cè)噲D轉(zhuǎn)入抗旱基因獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿植株，隨后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因苜蓿次級(jí)體細(xì)胞胚，將獲得的抗旱轉(zhuǎn)基因苜蓿植株次級(jí)體細(xì)胞胚作為外植體，轉(zhuǎn)入抗寒基因，最終實(shí)現(xiàn)多基因的共轉(zhuǎn)化苜蓿植株，為苜蓿多基因共轉(zhuǎn)化開辟途徑。

總之，在不同苜蓿品種中，初級(jí)體細(xì)胞胚能有效誘導(dǎo)次級(jí)體細(xì)胞胚，并能通過次級(jí)體細(xì)胞胚的遺傳介導(dǎo)再生為轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。比較苜蓿植株其他的器官做外植體的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，這種新的轉(zhuǎn)化體系能縮短培養(yǎng)周期、提高誘導(dǎo)率。而且，提供了一個(gè)快速導(dǎo)入多基因到苜蓿植株中的方法。為苜蓿品質(zhì)改進(jìn)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)的研究提供理論依據(jù)，這種方法也適用于別的轉(zhuǎn)化方法效率低的一些苜蓿品種，拓寬了苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法。

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