孫浩,劉寅,于靜,賀新生,何培新

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州450002；2.西南科技大學生物科學與工程學院,四川綿陽621002）

紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola（Swartz.：Fr.）Karst.,異名紅緣層孔菌Fomes pinicola（Sw.：Fr.）Cke.、紅緣多孔菌,是針葉樹原木上常見的木材腐朽菌,隸屬于擔子菌綱Basidiomycetes、非褶菌目Aphyllophorales、多孔菌科Polyporaceae、擬層孔菌屬Fomitopsis[1-3].現(xiàn)代藥理學研究證明,該菌子實體提取物具有抗菌、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、調(diào)節(jié)人體免疫以及抗氧化和清除游離基的作用[4],而菌絲體的相關(guān)研究報道較少.本研究初步優(yōu)化了紅緣擬層孔菌的液體發(fā)酵條件,并定性分析了菌絲體主要化學成分,為該菌的進一步開發(fā)利用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紅緣擬層孔菌分離于四川省綿陽市樹木發(fā)生的野生子實體標本.菌種保藏于鄭州輕工業(yè)學院微生物學實驗室.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA加富培養(yǎng)基土豆250 g,葡萄糖10 g,蛋白胨2 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,瓊脂20 g,自來水1000 mL,pH自然.用于菌種活化和菌種保藏.

1.2.2 搖瓶種子培養(yǎng)基PDA加富培養(yǎng)基不用瓊脂,250 mL三角瓶分裝80 mL培養(yǎng)基,透氣塞封口.用于種子培養(yǎng)和適宜pH測定.

1.2.3 碳源和氮源測定基礎培養(yǎng)基土豆250 g,碳源20 g,氮源2 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,自來水1000 mL,

pH自然.每250 mL三角瓶分裝80 mL培養(yǎng)基,透氣塞封口.

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備冰箱保存的菌種轉(zhuǎn)接PDA加富培養(yǎng)基斜面,25℃培養(yǎng)10 d.取活化菌種1 cm2左右接種搖瓶種子培養(yǎng)基,25℃150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d,液體培養(yǎng)物加入無菌磁棒和玻璃珠,磁力攪拌2 h,得到的菌絲懸浮液作為種子使用.

1.3.2 菌絲生長適宜碳源測定以不加碳源的基礎培養(yǎng)基為對照,氮源采用0.2%蛋白胨（w/v,下同）,選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、玉米淀粉、土豆淀粉等7種常見碳源,試驗濃度為2%.接種菌絲懸浮液（接種量8%）,26℃155 r/min振蕩培養(yǎng)12 d.抽濾獲得菌絲體,60℃烘干至恒重,稱重得到菌絲體干重,為菌絲生物量.每個測試保證有3瓶無污染的培養(yǎng)物,以3瓶培養(yǎng)物的菌絲體干重平均值（g/80 mL）為評價指標,確定最佳的碳源.

1.3.3 菌絲生長適宜氮源測定以不加氮源的基礎培養(yǎng)基為對照,碳源采用2%葡萄糖,選擇蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉、麩皮（取汁）、豆餅粉（取汁）等7種常見氮源,實驗濃度為0.2%.其他操作及數(shù)據(jù)處理同1.3.2.

1.3.4 菌絲生長適宜pH測定用鹽酸和NaOH調(diào)節(jié)PDA加富培養(yǎng)基pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,以自然pH（6.2）作對照.其他操作及數(shù)據(jù)處理同1.3.2.

1.3.5 菌絲體化學成分定性分析稱取干菌絲體3 g,研缽充分磨碎后過100目篩,得到菌絲體粉末.加入30 mL蒸餾水浸泡過夜,濾紙過濾.取3 mL濾液,用于氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的定性分析.剩余濾液60℃水浴加熱10 min,用于還原糖、多糖、有機酸、皂甙、甙類、酚類化合物和鞣質(zhì)等的定性測定.稱取菌絲體粉末3 g,加入30 mL95%乙醇,60℃水浴迥流20 min,濾紙過濾.濾液用于黃酮類物質(zhì)、蒽醌、鞣質(zhì)、甙類、有機酸、香豆素、萜類、內(nèi)酯和甾體化合物等的定性測定.各種物質(zhì)的定性測定方法見參考文獻[5].

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

測試碳源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響見圖1.

圖1 測試碳源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Fig.1 Influence of tested carbon source on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由圖1可知,以乳糖為碳源的培養(yǎng)基菌絲體生物量最高,其次為蔗糖,且兩者差別較大,所以紅緣擬層孔菌菌絲生長的最佳碳源為乳糖.

2.2 氮源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

測試氮源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響見圖2.

圖2 測試氮源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Fig.2 Influence of tested nitrogen source on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由圖2可知,以豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基菌絲體生物量最大,其次為蛋白胨和麩皮；且豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基菌絲體生物量明顯高于其他氮源.豆餅粉營養(yǎng)豐富而全面,不僅含有真菌菌絲生長的多種氮素營養(yǎng)物質(zhì),還含有多種生長因子,有利于菌絲的生長.與對照相比,亞硝酸鈉沒有顯著促進菌絲生長.紅緣擬層孔菌菌絲生長的最佳氮源為豆餅粉.

2.3 pH對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

pH對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響見圖3.

圖3 pH對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Fig.3 Influence ofpH value on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由圖3可知,當培養(yǎng)基pH為5.0時,紅緣擬層孔菌菌絲生長較慢,隨著pH的逐漸上升,菌絲生長速度不斷增加,至pH7.0時達到最高,然后逐漸下降.因此,紅緣擬層孔菌菌絲生長的最適宜pH為7.0.

2.4 紅緣擬層孔菌菌絲體主要化學物質(zhì)

定性測定結(jié)果表明,紅緣擬層孔菌菌絲體中含有有機酸、還原糖、多糖、甾體及三萜類化合物、香豆素、揮發(fā)油等多種化學成分.在檢測中還發(fā)現(xiàn),還原糖、多糖、甾體及三萜類化合物等對反應試劑非常靈敏,表明紅緣擬層孔菌菌絲體中這些化學物質(zhì)的含量較高.菌絲體中不含有生物堿、皂甙、內(nèi)酯、酚類化合物、鞣質(zhì)、黃酮類化合物、強心甙和蒽醌類等物質(zhì).

3 結(jié)論與討論

本研究表明,紅緣擬層孔菌菌絲生長的最佳碳源為乳糖,最佳氮源為豆餅粉,最適宜pH為7.0；而Choi等[6]研究表明,紅緣擬層孔菌菌絲發(fā)酵的最適pH為6.0,最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為酵母膏和麥芽汁.這種差別表明,不同地域分布的紅緣擬層孔菌菌株的菌絲生活條件可能不同,因此需要對不同菌株的菌絲培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,以更加科學地指導生產(chǎn)應用.

紅緣擬層孔菌子實體中含有多種三萜類、多糖類、腦苷脂類、揮發(fā)性等成分[3],但菌絲體的化學成分分析沒見報道.本研究表明,紅緣擬層孔菌菌絲體中含有有機酸、還原糖、多糖、甾體及三萜類化合物、香豆素、揮發(fā)油等多種化學成分,且還原糖、多糖、甾體及三萜類化合物等含量較高.靈芝GanodermASpp.三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、降血糖、抑菌和抗氧化等作用[7-8]；真菌多糖具有抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、抗病毒、抗衰老、抗輻射、抗白血病、健胃保肝等多種功效[9].液體培養(yǎng)獲得真菌菌絲體,具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)限制、成本低廉等優(yōu)點.因此,進一步優(yōu)化菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)條件,定量測定紅緣擬層孔菌菌絲體的活性成分,有針對性地提高這些活性物質(zhì)的含量,對開發(fā)利用該真菌菌絲體產(chǎn)品具有較大的理論意義和應用價值.

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社,1999.

[2] 戴玉成,徐梅卿,楊忠,等.中國儲木及建筑木材腐朽菌（1）[J].林業(yè)科學研究,2008,21（1）：49-54.

[3] 趙興華,包海鷹,崔寶凱.紅緣擬層孔菌化學成分與藥理活性研究概述[J].菌物研究,2010,8（2）：119-124.

[4] 戴玉成,圖力古爾.中國東北野生食藥用真菌圖志[M].北京：科學出版社,2007.

[5] 孫迎節(jié).蒙山九州蟲草藥用價值及其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機理研究[D].濟南：山東大學,2003：40-45.

[6] ChoID,Maeng J M,Ding J L,et a1.Exopolysaccharide production and mycelial growth in an air-lift bioreactor using Fomitopsis pinicola[J].Journal ofMicrobiologyand Biotechnology,2007,17（8）：1369-1378.

[7] Huie C W,Di X.Chromatographic and electrophoreticmethods for Lingzhi pharmacologically active components[J].Journal of ChromatographyB,2004,812（1/2）：241-257.

[8] Russell R,Paterson M.Ganoderma-a therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry,2006,67（18）：1985-2001.

[9] 杜慶.食（藥）用真菌多糖的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng),2011,17（5）：75-77.