鐘希文，張文霞，曾聰彥，曾希娜（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東中山 528400）

紫外分光光度法測定蛇鱗草根莖和葉中總黃烷醇苷的含量

鐘希文＊，張文霞，曾聰彥，曾希娜（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東中山 528400）

目的：建立測定蛇鱗草根莖和葉中總黃烷醇苷含量的方法。方法：以三羽新月蕨素A為對照品，采用紫外分光光度法，在280 nm波長處測定樣品吸光度。結(jié)果：總黃烷醇苷的檢測濃度在0.020～0.100mg·m L－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 5）；平均加樣回收率為99.0%，RSD＝1.3%（n＝6）。結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于蛇鱗草的質(zhì)量控制。

蛇鱗草；紫外分光光度法；總黃烷醇苷；含量測定；三羽新月蕨素A

蛇鱗草為金星蕨科（Thelypteridaceae）新月蕨屬（Abacopteris）三羽新月蕨Pronephrium triphyllum（Sw.）Holtt.的全草，在廣東地區(qū)作為民間草藥使用，具有清熱解毒、消腫散瘀、化痰止咳等功效，主要用于治療癰瘡癤腫，毒蛇咬傷，濕疹，皮膚瘙癢，急、慢性氣管炎等[1]。據(jù)文獻(xiàn)報道，金星蕨科藥用植物主要含有黃酮類化合物，其中黃烷-4-醇類化合物是該科植物的特征性成分[2～4]。至目前為止，日本學(xué)者從蛇鱗草中分出三羽新月蕨素A、B、C（TriphyllinsA、B、C）3個黃烷-4-醇類化合物[5]。筆者的前期藥理實驗表明，蛇鱗草全草水提液具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛[6]、鎮(zhèn)咳祛痰[7]及一定的抑菌殺菌[8]作用；且在對其化學(xué)成分的研究中，從該植物中得到蛇鱗草苷A、Triphyllin A、6，7-二羥基香豆素、正丁基-β-D-吡喃果糖苷等化合物，其中Trphyllin A含量高達(dá)近5 g，為總黃烷醇苷的主要組成成分[9]。故本試驗以Trphyllin A為指標(biāo)，首次采用紫外分光光度法對蛇鱗草的根莖和葉中總黃烷醇苷的含量進(jìn)行了測定，以期為蛇鱗草及其制劑的開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ3200E超聲儀（昆明市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：120W）；BS-224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海衡平儀器儀表廠）；東方-A直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）。

蛇鱗草采自廣東中山市五桂山，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)潘超美教授鑒定為金星蕨科植物三羽新月蕨P.triphyllum（Sw.） Holtt.的全草。Triphyllin A標(biāo)準(zhǔn)品由筆者分離制備，結(jié)構(gòu)已由紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）和核磁共振（NMR）等波譜分析鑒定，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）歸一化法計算在98%以上；所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

將干燥的蛇鱗草全草根莖、葉進(jìn)行分離，粉碎成粗粉，備用。分別稱取蛇鱗草根莖、葉的粗粉各約5 g，置索氏提取器中，加氯仿150m L，加熱回流至提取液無色，棄去氯仿提取液。待氯仿?lián)]干后，將粉末置于烘箱中60℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，備用。取處理后的樣品0.2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇10m L，稱定重量，加熱回流70 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，濾液備用。重復(fù)上述操作3次，分別精密吸取3次續(xù)濾液各1 m L，置25m L容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取于105℃干燥至恒重的Triphyllin A標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50m L容量瓶中，加入70%乙醇定容，超聲溶解，搖勻，配成濃度為0.20mg·m L－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏，備用。

2.3 檢測波長的確定

將稀釋至一定程度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液以70%乙醇為空白對照，在波長為200～400 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液均在280 nm波長處有最大吸收（見圖1），故確定檢測波長為280 nm。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 UV掃描圖A.Triphyllin A對照品；B.供試品Fig 1 UV scan chromatogram sA.Triphyllin A control；B.samples

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L，分別置于10m L容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，以70%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度。以濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝6.955c+ 0.063 7（r＝0.999 5，n＝5）。結(jié)果表明，Triphyllin A的檢測濃度在0.020～0.100mg·m L－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按上述色譜條件連續(xù)測定5次。結(jié)果，RSD＝0.33%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取5m L供試品溶液，置于25m L容量瓶中，70%乙醇定容。分別于0、1、2、4、8、12 h測定吸光度，計算藥材中總黃烷醇苷的含量。結(jié)果，RSD＝1.7%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取處理后的同一批次蛇鱗草樣品0.2 g，共6份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液。分別以70%乙醇為空白對照，在280 nm波長處測定吸光度，計算藥材中總黃烷醇苷的含量。結(jié)果，同批藥材6次測定總黃烷醇苷的平均含量為10.2%，RSD＝1.9%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取處理后的已知總黃烷醇苷含量的蛇鱗草樣品0.1 g，共6份，置圓底燒瓶中，分別加入適量Triphyllin A標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液。分別以70%乙醇為空白對照，在280 nm波長處測定吸光度，計算藥材中總黃烷醇苷的含量和加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

分別精密稱取不同批次的蛇鱗草根莖、葉粗粉各0.2 g，置圓底燒瓶中，按“2.1”項下方法制備供試品溶液。分別以70%乙醇為空白對照，在280 nm波長處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于Triphyllin A的量，計算藥材中總黃烷醇苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determ ination of sam p les（n＝3）

由表2可知，蛇鱗草的根莖與葉所含總黃烷醇苷的含量差異較大，以Triphyllin A計，根莖、葉的平均含量分別為10.3%、8.9%。

3 討論

在植物代謝產(chǎn)物中，黃烷-3-醇及其苷類，如兒茶素類和原花色素類化合物比較常見，而黃烷-4-醇及其苷類相對比較少見。從文獻(xiàn)[2～4]來看，黃烷-4-醇類在金星蕨科植物中大量分布，故可以把此類成分作為該科特征性成分之一。筆者前期蛇鱗草化學(xué)成分研究表明，黃烷-4-醇苷類化合物是蛇鱗草中主要成分，其中含量最高的為Triphyllin A，故以Triphyllin A作為質(zhì)量控制指標(biāo)具有較強(qiáng)的可操作性。紫外分光光度法是鑒定黃酮類化合物的一種重要技術(shù)，目前被廣泛用于測定中藥中的總黃酮。因此，本試驗以紫外分光光度法測定蛇鱗草根莖、葉中總黃烷醇苷類化合物的含量。試驗結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、精密度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、加樣回收率合格，可作為測定蛇鱗草中總黃烷醇苷含量的一種有效方法。

由于所測總黃烷醇苷極性相對較大，其在石油醚、氯仿中的溶解度非常小，因此在樣品提取時分別采用了石油醚和氯仿進(jìn)行脫脂脫色預(yù)處理，并與不進(jìn)行預(yù)處理直接提取所得供試品溶液總黃烷醇苷含量進(jìn)行比較。結(jié)果表明，不進(jìn)行預(yù)處理所得供試品溶液中的總黃烷醇苷含量最低，而用氯仿處理比用石油醚處理所得的含量要高，表明采用氯仿除雜質(zhì)后能顯著減少雜質(zhì)對待測總黃烷醇苷的干擾，故本試驗選擇以氯仿作為脫脂脫色溶劑對蛇鱗草的根莖、葉進(jìn)行預(yù)處理。在選擇提取溶劑時，比較了甲醇和乙醇提取的效果，結(jié)果表明2種溶媒的提取效果無明顯差異，考慮到甲醇的毒性，故選擇乙醇作為提取溶劑。此外，試驗對蛇鱗草的根莖與葉分別測定其總黃烷醇苷的含量，從而可清楚地得知總黃烷醇苷在蛇鱗草植物體內(nèi)的分布情況，為蛇鱗草及其制劑的進(jìn)一步深入開發(fā)與研究提供參考依據(jù)。

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Determ ination of Total Flavanol Glycosides in Rhizome and Leaves ofPronephrium triphyllumby UV Spectrophotometry

ZHONG Xi-wen，ZHANGWen-xia，ZENG Cong-yan，ZENG Xi-na（Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine A ffiliated to Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Zhongshan 528400，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determ ination of the total flavanol glycosides in rhizome and leaves ofPronephrium triphyllum.METHODS：Using triphyllin A as control，the total flavanol glycosides were determined by spectrophotometric method atwavelength of 280 nm.RESULTS：The linear range of total flavanol glycosideswas 0.020～0.100mg·m L－1（r＝0.999 5）w ith an average recovery of 99.0%（RSD＝1.3%，n＝6）.CONCLUSION：Themethod is simple，rapid and accurate，and can be used for quality control ofP.triphyllum.

Pronephrium triphyllum；UV spectmphotometric method；Total flavanol glycosides；Content determ ination；Triphyllin A

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）23-2176-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.25

＊主任中藥師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：新藥開發(fā)與中藥藥理。電話：0760-88815106。E-mail：zszxw68@126.com

2011-10-08

2012-02-24）