張惠 陳衛(wèi)昌

三氧化二砷對大腸癌LoVo細胞生長及Bcl-2、Bax表達的影響

張惠 陳衛(wèi)昌

目的 研究三氧化二砷(As2O3)對人大腸癌細胞株LoVo中的生長及三氧化二砷對Bcl-2、Bax表達的影響。方法 采用不同濃度的As2O3處理LoVo細胞，MTT法測定細胞的生長抑制效應;免疫細胞化學法檢測人結腸癌細胞LoVo中Bcl-2、Bax的表達。結果 MTT結果示As2O3對大腸癌LoVo細胞的生長有抑制作用，且有時間-劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01);免疫細胞化學法結果示As2O3可使LoVo細胞中Bcl-2表達下降，Bax表達升高(P＜0.01)。結論 三氧化二砷對大腸癌細胞生長有抑制作用，且呈時間、劑量依賴性;其機制可能與改變Bcl-2和Bax的表達水平有關。

As2O3;大腸癌;Bcl-2;Bax

三氧化二砷(Arsenic Trioxide，As2O3)是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，現(xiàn)已成為國內外研究熱點。研究表明，三氧化二砷對多種實體瘤的增殖有抑制作用，亦可抑制人大腸癌細胞的生長，其機制可能是抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡［1-3］，但As2O3對大腸癌Bcl-2及Bax表達的影響的相關研究較少。本實驗用As2O3作用于人大腸癌LoVo細胞株，觀察腸癌細胞的生長及Bcl-2、Bax表達變化，旨在探討三氧化二砷的抗腫瘤機制及防治腸癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人大腸癌LoVo細胞系(中科院上海細胞生物學研究所)，在含10%胎牛血清的RPMI-1640(Gibco公司產(chǎn)品)完全培養(yǎng)液、37℃、含5%CO2、95%空氣、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 三氧化二砷(1 g/L)(美國Sigma公司)，4℃冰箱保存，實驗前用培養(yǎng)基稀釋As2O3(終濃度分別為1.5μmol/L;3.0μmol/L;6.0μmol/L)。四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma公司)。Bcl-2、Bax免疫化學一抗、二抗(武漢博士德生物公司)。

1.3 實驗分組 實驗分為:對照組(未給藥)，實驗組1(As2O31.5μmol/L)，實驗組2(As2O33.0μmol/L)，實驗組3(As2O36.0μmol/L)

1.4 四氮唑藍(MTT)比色還原法檢測 按試劑盒說明書對各組進行實驗，用酶標儀檢測490nm波長處的每孔吸光度值(Absorbance，A 值)，計算細胞生存率(Survival Rate，SR)，以對照組的細胞生存率作為100%。細胞生存率(SR)=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.5 免疫細胞化學法檢測 收集不同濃度處理48 h后的各組腸癌細胞，按SP法操作。Bcl-2、Bax蛋白表達結果判定:細胞胞漿或胞膜染為棕黃色為陽性。在高倍鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)1000個細胞，以陽性細胞占總數(shù)的百分比作為陽性細胞百分率。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析所有實驗數(shù)據(jù)，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 As2O3對大腸癌LoVo細胞生長的影響 MTT結果表明As2O3在1.5μmol/L濃度干預24 h后開始表現(xiàn)抑制作用，但作用尚不顯著，隨著濃度增加和作用時間延長，As2O3對腸癌細胞的抑制作用漸增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。見表1。

表1 As2 O3對腸癌細胞生存率的影響(%)

2.2 三氧化二砷對大腸癌細胞株中Bcl-2、Bax蛋白表達影響 大腸癌細胞對照組中的Bcl-2蛋白表達明顯，陽性率為(87.50±5.10)%，經(jīng) As2O3作用后，實驗組1(As2O31.5 μmol/L)Bcl-2蛋白陽性表達受到抑制，陽性率為(76.52±4.92)%，實驗組2(As2O33.0μmol/L)Bcl-2蛋白表達減弱，陽性率為(55.95±2.24)%，實驗組3(As2O36.0μmol/L)Bcl-2蛋白表達明顯下降，陽性率為(35.95±3.24)%，有劑量依賴性，各組細胞Bcl-2蛋白的表達差異顯著，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Bax蛋白在對照組微弱表達，陽性率為(15.42±3.12)%，經(jīng)As2O3作用后，隨著濃度增加，各組表達增強，陽性率分別(26.73±3.72)%，(45.83±3.26)%，(73.68±2.15)%，有劑量依賴性，各組細胞Bax蛋白的表達差異顯著，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

三氧化二砷是從砒霜中提煉出來的有效藥用成分，其用于治療白血病已取得較好的療效，現(xiàn)將其應用于肝癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等多種實體瘤的實驗和臨床研究［1-3］亦漸增多，研究結果顯示了良好的前景。研究表明，三氧化二砷主要是通過誘導細胞分化和凋亡抑制細胞生長而起抗腫瘤作用。劉琳等［4］通過臺盼蘭染色法和MTT法等觀察體外活細胞生長，結果揭示As2O3可以明顯抑制體外人大腸癌CoLo-320細胞的生長，并呈時效和量效特點;電子超微結構觀察顯示，As2O3可誘導人大腸癌細胞出現(xiàn)腫瘤細胞典型的凋亡形態(tài)學改變。

Bcl-2基因家族是目前最具代表性的調控細胞凋亡的基因家族，其家族主要成員包括兩大類:一類是抑制細胞凋亡的基因，如bcl-2、bcl-xl、mcl-1等，bcl-2是其中最重要的基因，其表達上調，凋亡受抑制;另一類是促進細胞凋亡的基因，如bax、bad、bcl-xs等，Bax是一種與bcl-2相關的蛋白，與bcl-2有40%的同源性，其表達上調，能加速細胞凋亡［5］。研究表明，bcl-2與bax比例決定細胞凋亡程度［6］。

大腸癌的侵襲和轉移過程比較復雜，其機制至今仍不甚清楚。本實驗研究顯示As2O3可下調大腸癌LoVo細胞Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，且呈時間-劑量依賴性，這為深入了解Bcl-2、Bax蛋白在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及研究開發(fā)Bcl-2、Bax蛋白的分子靶向治療藥物提供了實驗依據(jù)，值得臨床進一步研究應用。

［1］Nakagawa Y，Akao Y，Morikawa H，et al.Arsenic trioxide-induced apoptosis through oxidative stress in cells of colon cancer cell lines.Life Sci，2002，29，70(19):2253-2269.

［2］Lin LM，Li BX，Xiao JB，etal.Synergistic effectof all-trans-retinoic acid and arsenic trioxide on growth inhibition and apoptosis in human hepatoma，breast cancer，and lung cancer cells in vitro.World JGastroenterol，2005，28，11(36):5633-5637.

［3］Chow SK，Chan JY，F(xiàn)ung KP.Suppression of cell proliferation and regulation of estrogen receptor alpha signaling pathway by arsenic trioxide on human breast cancer MCF-7 cells.JEndocrinol，2004，182(2):325-37.

［4］劉琳，邱少敏，趙偉，等.As2O3注射液體外對人大腸癌細胞抑制作用的觀察.南京中醫(yī)藥大學學報，2004，20(1):42.

［5］Yang E，Zha J，Jockel J，et al.Bad，a heterodimeric partner for bcl-XL and bcl-2 displaces bax and promotes cell death.Cell，1995，80(2):285-291.

［6］Erdogan S，Ozer AY，BilgiliH.In vivo behaviour of vesicular urokinase.International Journal of Pharmaceutics，2005，295(1-2):1-6.

Effects of grow th and Bcl-2 and Bax expression by arsenic trioxide in hum an colorectal cancer LoVo c e l l s

ZHANGHui，CHENWei-chang.Department of Onclogy，Suzhou Municipal Hospital(North Area)，Suzhou2 1 5 0 0 8，，China

Objective To investigate the effects of arsenic trioxide on the cell growth and the expression of Bcl-2 and Bax in human colorectal cancer cells.M ethods In vitro，human colorectal cancer cells was treated by As2O3in various concentrations，and then MTTmethod was used to assay the effect of cell growth inhibition;the immunocytochemistry(ICC)analyzed the expression of Bcl-2 and Bax.Results As2O3inhibited the growth of the human colorectal carcinoma cells，and the inhibition effectwas time-dose dependent(P ＜0.05 or P ＜0.01).Bcl-2 expression was downregulated，and Bax expression was upregulated(P ＜0.01).Conclusion Arsenic trioxide had inhibition effect on the growth of human colorectal cancer cells in a time-dose dependentmanner，which may change the Bcl-2 and Bax expression and the level.

Arsenic trioxide;colorectal cancer;Bcl-2;Bax

215008 蘇州市立醫(yī)院北區(qū)腫瘤科(張惠);蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(陳衛(wèi)昌)