陳耀國

(上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司，上海201206)

周質(zhì)空間(periplasmic space)是由大腸桿菌內(nèi)膜和外膜組成的雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠提供一個適合外源蛋正確折疊的環(huán)境.利用大腸桿菌系統(tǒng)，在外源基因的N端融合一段細(xì)菌蛋白的疏水信號肽，可將目的蛋白運送到周質(zhì)空間，經(jīng)信號肽酶將信號肽切除后，即可獲得與天然蛋白一致的構(gòu)象(不含N端多余的甲硫氨酸)［1］.本研究所構(gòu)建的工程菌可分泌人生長激素到周質(zhì)空間中，并采用滲透壓沖擊法提取目的蛋白.

1 材料和方法

1.1 菌株 Escherichia coli BL21(Novagen公司)，質(zhì)粒pIN－III－OmpA－h(huán)GH由公司研發(fā)工藝部提供.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)基 選用LB培養(yǎng)基，用前加入氨芐西林鈉50 mg?L－1.

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 Glucose 5 g?L－1，Tryptone 10 g?L－1，Yeast extract 5 g?L－1，KH2PO43 g?L－1，Na2HPO46 g?L－1，(NH4)2SO41.2 g?L－1，MgSO40.5 g?L－1，CaCl20.15 g?L－1，泡敵0.2 mL?L－1(葡萄糖單獨滅菌，發(fā)酵前加入).

1.2.3 補料培養(yǎng)基 Glucose 350 g?L－1，Tryptone 300 g?L－1.

1.3 發(fā)酵罐 5 L發(fā)酵罐，為上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品.

1.4 種子液的制備 取－70℃甘油菌1‰接種到50 mL (250 mL錐形瓶)的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r?min－1，培養(yǎng)12～15 h進行菌種活化.將活化好的菌液以2%的接種量加入到200 mL(500 mL錐形瓶)LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r?min－1，培養(yǎng)4～5 h即為種子液.

1.5 發(fā)酵培養(yǎng) 培養(yǎng)基體積為3 L，pH控制在7.20±0.20，由發(fā)酵控制系統(tǒng)自動補入4 mol?L－1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH.培養(yǎng)溫度控制在(37±0.5)℃，發(fā)酵過程控制溶氧在30%以上，當(dāng)溶氧低于30%時通過提高通氣量和攪拌速度提高溶氧.當(dāng)發(fā)酵進行到3.5～4 h后，溶氧開始上升時，以25～30 mL?h－1的流速滴加補料液，補料體積為300 mL.

1.6 周質(zhì)蛋白的提取 取200 mL的發(fā)酵液，加入不同濃度的蔗糖和EDTA，室溫150 r?min－1，溫育20 min，4℃ 14 000 ×g離心20 min，棄高滲液，向菌泥中加入60 mL的4℃ RO水，輕輕攪勻，冰浴20 min，4℃14 000×g離心20 min，得60 mL上清液即為周質(zhì)蛋白，試驗重復(fù)兩次.

蛋白含量測定:采用Bradford法［2］.以對照品溶液濃度與其相對應(yīng)的吸光度計算線性回歸方程.另精密量取待測樣品溶液適量，同法測定，從線性回歸方程計算待測樣品溶液中的蛋白濃度，并乘以稀釋倍數(shù).

SDS－PAGE分析:取周質(zhì)蛋白溶液50 μL與2×Loading Buffer等比例混勻，100℃水浴加熱5～10 min，按文獻(xiàn)［3］方法進行SDS－PAGE電泳，分離膠溶液的濃度為15%.

2 結(jié)果

2.1 不同蔗糖濃度對生長激素回收率的影響 加入終濃度0～30%的蔗糖溫育發(fā)酵液20 min，SDS－PAGE表明，隨著蔗糖濃度的增加，周質(zhì)蛋白中的hGH含量也逐漸增多，蔗糖溶液濃度為20%和30%時，hGH含量達(dá)到較高水平(見圖1).表1數(shù)據(jù)也表明了蛋白含量逐漸增多的趨勢.考慮到生產(chǎn)成本以及操作的可行性，試驗采用20%濃度的蔗糖溫育發(fā)酵液.

表1 不同蔗糖濃度周質(zhì)蛋白含量

圖1 不同蔗糖濃度SDS－PAGE分析

2.2 不同EDTA濃度對生長激素回收率的影響 加入終濃度20%的蔗糖和0～20 mmol?L－1的EDTA溫育發(fā)酵液20 min，SDS－PAGE表明，不同濃度EDTA溫育發(fā)酵液，周質(zhì)蛋白中的hGH含量相差不明顯(見圖2).表2數(shù)據(jù)表明，10 mmol?L－1和15 mmol?L－1的EDTA條件下的周質(zhì)蛋白含量較高，分別為2 472 μg?mL－1和2 559 μg?mL－1.考慮到兩者h(yuǎn)GH含量差不多，試驗采用10 mmol?L－1濃度的EDTA溫育發(fā)酵液.

表2 不同EDTA濃度周質(zhì)蛋白含量

圖2 不同EDTA濃度SDS－PAGE分析

2.3 不同CaCl2濃度對生長激素回收率的影響 加入0～20 mmol?L－1的CaCl2溶液預(yù)處理發(fā)酵液10 min，再加入終濃度20%的蔗糖和10 mmol?L－1的EDTA溫育發(fā)酵液20 min，SDS－PAGE表明，不同濃度CaCl2溶液中，1 mmol?L－1的CaCl2溶液預(yù)處理發(fā)酵液后，周質(zhì)蛋白中的hGH含量最高(見圖3).表3數(shù)據(jù)表明，隨著Ca2+濃度的升高，周質(zhì)蛋白含量逐漸減少，15 mmol?L－1和20 mmol?L－1濃度Ca2+預(yù)處理發(fā)酵液后，相應(yīng)周質(zhì)蛋白含量反而低于空白對照.

表3 不同CaCl2濃度周質(zhì)蛋白含量

圖3 不同CaCl2濃度SDS－PAGE分析

3 討論

大腸桿菌外膜主要組成為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，LPS具有吸附Mg2+、Ca2+等陽離子的作用，利用EDTA的螯合陽離子的能力，與吸附于LPS表面上的Ca2+結(jié)合，提高細(xì)胞外膜的通透性，以增加周質(zhì)蛋白的回收［4］.本研究用Ca2+預(yù)處理發(fā)酵液，隨著 Ca2+濃度的升高，過多的Ca2+與EDTA結(jié)合，反而削弱了外膜的通透性，導(dǎo)致周質(zhì)蛋白回收的減少.1 mmol?L－1濃度Ca2+預(yù)處理發(fā)酵液10 min，能提高周質(zhì)蛋白回收率為17.8%(表3數(shù)據(jù)得出).另外，以往滲透壓沖擊法先離心發(fā)酵液收集菌體，再加入蔗糖溶液重懸菌體.本研究直接向發(fā)酵液加入終濃度為20%的蔗糖，減少了一次離心和重懸程序，減輕了操作者的勞動強度和節(jié)約了能源消耗.改進后的滲透壓沖擊法可以處理濕重為40～60 g?L－1的發(fā)酵液.

［1］ 李振國，徐明波，牛罡，等.在大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)重組蛋白的研究進展［J］.藥物生物技術(shù)，2011，18(1):73－76.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄VII M.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(三部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅣC.

［4］ Chen YC，Chen LA，Chen SJ，et al.A modified osmotic shock for periplasmic release of a recombinant creatinase from Escherichia coli［J］.Biochem Eng J，2004，19(3): 211－215.