毛 丹，許 勇，鄭 榮，陳 鈳，王 柯，季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又稱F2毒素，它首先從有赤霉病的玉米中分離得到，是由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和三線鐮刀菌(F.tricinctum)等鐮刀菌屬產(chǎn)生，主要污染玉米、小麥、大米、大麥等谷物.玉米赤霉烯酮具有生殖毒性、血液毒性、細胞毒性、免疫毒性和遺傳毒性，可導致生殖障礙、消化系統(tǒng)功能紊亂［1］.玉米赤霉烯酮廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥等谷類作物和奶制品中，A.K.ROY等人從蒺藜等六種草藥中檢測到了玉米赤霉烯酮［2］，而Trucksess MW等人則曾報道過玉米赤霉烯酮存在于干燥人參的根粗提物中［3］.為此，建立中藥中玉米赤霉烯酮的檢測方法，不僅可以確保人民用藥安全，也可以為監(jiān)督執(zhí)法提供強有力的技術(shù)支撐.

目前玉米赤霉烯酮的分析測定方法基本應用于食品領域，一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)［4～8］.TLC法繁瑣、耗時、靈敏度低，進行目視定量時主觀性影響較大，且測定時大量接觸到ZEN標準品，不利于實驗人員的健康保護.而ELISA法適用于大量樣品的篩選和普查，但由于酶本身的不穩(wěn)定性，用此方法進行玉米赤霉烯酮的檢驗有可能帶來假陽、陰性結(jié)果，難以達到定量的相關(guān)技術(shù)要求.目前食品中比較常用的玉米赤霉烯酮高效液相色譜測定方法，采用免疫親和柱進行供試品溶液的凈化，由于免疫親和柱對玉米赤霉烯酮具有專屬性吸附，出現(xiàn)假陽性的情況少.本文鑒于中藥基質(zhì)的復雜性，經(jīng)實驗摸索研究，建立了中藥中免疫親和凈化－高效液相色譜的測定方法，若有陽性樣品，則采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進行確證.該方法重復性好、回收率高、簡便靈敏，可作為中藥中玉米赤霉烯酮的測定方法.

1 儀器與材料

高速均質(zhì)器(德國IKA公司提供，轉(zhuǎn)速采用12 500 r?min－1);玉米赤霉烯酮免疫親和柱(美國VICAM公司);美國AgiLent 1100高效液相色譜儀，熒光檢測器;玉米赤霉烯酮對照品(ALEXIS公司提供，Lot:L16748/b).薏苡仁、麥芽、綠豆藥材均由華宇藥材有限公司提供，經(jīng)上海市食品藥品檢驗所鑒定.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS－3柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈 －水(50∶50)，流速1.0 mL?min－1，以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長232 nm，發(fā)射波長460 nm，柱溫:30℃，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，結(jié)果見圖1.

圖1 高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末40 g(過二號篩)，精密稱定，置均質(zhì)杯中，加入氯化鈉4 g，精密加入90%乙腈100 mL，高速攪拌2 min，離心5 min(離心速度4 000 r?min－1)，精密吸取上清液10 mL，用水稀釋至50 mL，搖勻，離心，精密吸取上清液10 mL，通過免疫親合柱(流速3 mL?min－1)，隨后用水10 mL洗脫(流速6 mL?min－1)，洗脫液棄去，精密量取1.5 mL甲醇洗脫(流速1 mL?min－1)，收集甲醇洗脫液，置2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得.

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取玉米赤霉烯酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL含250 ng的溶液，作為對照品溶液(1).精密吸取對照品溶液(1)1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(2).分別精密吸取上述對照品溶液(1)2 μL、5 μL、10 μL、15 μL，對照品溶液(2)5 μL、10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積.以進樣量(pg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，回歸方程為:Y=1.970 7×10－2X－1.273 66×10－1，r=0.999 83(n= 6);結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮在進樣量為125～375 0 pg范圍內(nèi)峰面積與進樣量線性關(guān)系良好.

2.4 進樣精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液(1)，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定，計算玉米赤霉烯酮色譜峰面積的RSD為0.7%，結(jié)果表明儀器精密度良好.

2.5 重復性試驗 取薏苡仁陽性樣品粉末40 g(過二號篩)，一式6份，精密稱定，，按供試品溶液的制備項下依法操作，進樣分析，計算RSD為5.2%，表明重復性試驗結(jié)果良好.供試品溶液采用LC－MS－MS進行陽性確證，結(jié)果供試品溶液中定性離子的豐度比與對照品溶液中定性離子的豐度比相接近(見表1).

表1 質(zhì)譜確證結(jié)果

2.6 回收率試驗 取本品粉末(過二號篩)40 g，精密稱定，一式3份，按低、中、高三種濃度水平分別精密加入玉米赤霉烯酮對照品1 μg、2.5 μg及7.5 μg，依法制備供試品溶液并測定含量，計算平均回收率(見表2)，結(jié)果表明回收率試驗結(jié)果良好.

表2 回收率試驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗 取重復性試驗用樣品，每隔5 h進樣分析，記錄峰面積并計算RSD為3.0%，結(jié)果表明，在0～25 h之內(nèi)，供試品溶液保持穩(wěn)定.

2.8 檢測限 測定低濃度回收率供試品溶液的信噪比，以信噪比3∶1計算得本方法檢測限為15 μg?kg－1，以信噪比10∶1計算得本方法定量限為50 μg?kg－1.

2.9 樣品測定

2.9.1 國際實驗室能力測試結(jié)果 按照本實驗所述方法參加由英國實驗室CSL主辦的能力驗證測試項目，結(jié)果為滿意.

2.9.2 樣品測定結(jié)果 對上述3種共計11批樣品進行檢驗，結(jié)果4批薏苡仁均檢出玉米赤霉烯酮，結(jié)果分別為325 μg?kg－1、30 μg?kg－1、268 μg?kg－1、178 μg?kg－1.

2.10 確證實驗 供試品溶液制備方法中使用的免疫親和柱對玉米赤霉烯酮具有專屬性吸附，因此一般情況下供試品溶液的高效液相色譜圖比較干凈，出現(xiàn)假陽性的情況比較少.筆者在近幾年的實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著監(jiān)測品種范圍和檢驗樣品數(shù)量的擴大，某些基質(zhì)復雜的樣品，有時會出現(xiàn)假陽性的情況.因此進一步的確證實驗就顯得非常必要.通常，建議通過改變色譜條件比如更換儀器和色譜柱，調(diào)節(jié)流動相比例等手段進行考察.有條件的實驗室，則應通過LC－MS進行確證.

本實驗采用LC－MS－MS對上述陽性樣品進行了確證實驗.色譜柱為Acquity Uplc Beh C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm);以甲醇為流動相A相，以0.01%甲酸為流動相B相，流速0.3 mL?min－1，按表3方法進行梯度洗脫.

表3 流動相梯度

離子源為電噴霧離子化源ESI(－)源;毛細管去簇電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)見表4.

表4 質(zhì)譜參數(shù)表

3 討論

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

3.1.1 波長的選擇 分別考察了:①激發(fā)波長232 nm，發(fā)射波長460 nm;②激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長460 nm;③激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm.結(jié)果以激發(fā)波長232 nm，發(fā)射波長460 nm所得色譜峰峰面積最大，峰高最高.

3.1.2 流動相系統(tǒng)的選擇 分別考察了:①乙腈 －水(50∶50);②乙腈－水－甲醇(46∶46∶8);③1%磷酸溶液－甲醇－乙腈(40∶30∶30)3種流動相，對稱因子分別為0.83、0.66、0.70.故選用對稱因子較好且毒性相對較小的乙腈－水(50∶50)為流動相.

3.1.3 色譜柱的選擇 分別考察了:①Intersil－ODS3(4.6 mm×150 mm，5 μm);②Agilent CB－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);③Waters C18(2.1 mm ×150 mm，5 μm)3種色譜柱，對稱因子分別為0.95、0.74、0.88，色譜柱①的對稱因子相對較好，本次實驗選擇色譜柱①進行研究.

3.2 供試品溶液制備方法的考察

3.2.1 提取過程 為有效的提取出玉米赤霉烯酮成分，對供試品溶液制備方法中提取溶劑、提取方式、提取時間等分別進行了考察.試驗中對提取溶劑進行選擇時，分別篩選了90%乙腈、90%甲醇、50%乙腈、50%甲醇4種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用90%乙腈勻漿提取2 min效率最高，故被采用.

3.2.2 凈化過程 為得到較好的色譜分離效果，采用可以特效性分離出玉米赤霉烯酮的免疫親和柱對3.2.1中提取液進行凈化，同時對淋洗液及洗脫溶劑進行了選擇.其中對淋洗液的種類(淋洗緩沖液和水)及用量分別進行了考察，本次試驗選用的3種藥材(麥芽、綠豆和薏苡仁)用水10 mL淋洗即可除去雜質(zhì)干擾，得到滿意的色譜分離效果;若其他樣品中出現(xiàn)干擾雜質(zhì)特別多的情況，可以先用5 mL淋洗緩沖液洗脫，再用5 mL水洗脫.

3.2.3 濃縮過程 氮吹為濃縮過程的常用方法.本次試驗比較了氮吹與不氮吹的效果，結(jié)果表明，氮吹與否并不影響最終測定結(jié)果.氮吹步驟相對繁瑣，因此在玉米赤霉烯酮含量可以滿足色譜分析需求的情況下則不采用氮吹的步驟.若玉米赤霉烯酮含量過低，無法滿足檢測靈敏度要求時，可通過氮吹方式進行濃縮，以得到滿意的測定結(jié)果.

3.3 確證實驗 鑒于中藥基質(zhì)的復雜程度，若采用免疫親和凈化－高效液相色譜法測定玉米赤霉烯酮的結(jié)果為陽性，則建議采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進行進一步確證.

3.4 中藥中玉米赤霉烯酮的限量 目前國內(nèi)外暫無中藥中玉米赤霉烯酮的限量標準，而在食品標準中對玉米赤霉烯酮的限量則有嚴格的規(guī)定.歐盟規(guī)定除玉米粉外的谷粉限量為75 μg?kg－1.巴西規(guī)定玉米中限量為200 μg?kg－1，奧地利規(guī)定小麥中限量為60 μg?kg－1.我國規(guī)定谷物及其制品如小麥、小麥粉、玉米、玉米面(渣、片)中玉米赤霉烯酮的限量標準為60 μg?kg－1［9］，飼料中玉米赤霉烯酮的限量標準為500 μg?kg－1［10］.鑒于玉米赤霉烯酮易滋生于谷物類產(chǎn)品，參照上述的玉米赤霉烯酮限量標準，建議將中藥中玉米赤霉烯酮的限度規(guī)定為60 μg?kg－1.

［1］ 姜淑貞，楊維仁，楊在賓.玉米赤霉烯酮的污染和殘留及其作用機制［J］.中國飼料，2011，2:41－44.

［2］ Roy AK，Chourasia HK.Mycoflora，mycotoxin producibility and mycotoxins traditional herbal drugs from India［J］.J Gen Appl Microbiol，1990，36(5):295－302.

［3］ Trucksess MW，Scott PM.Mycotoxins in botanicals and dried fruits:a review［J］.Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess，2008，25(2):181－192.

［4］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中真菌毒素限量［S］.食品安全國家標準GB 2715－2005，2005.

［5］ 國家認證認可監(jiān)督管理委員會.進出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的檢驗方法［S］.出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 1745－2006，2006.

［6］ Kruger SC，Kohn B，Ramsey CS，et al.Rapid immunoaffinity－based method for determination of zearalenone in corn by fluorometry and liquid chromatography［J］.J AOAC Int，1999，82(6):1364－1368.

［7］ 葉蔚云，陳永紅.高效液相色譜法測定小麥、玉米中玉米赤霉烯酮［J］.中國公共衛(wèi)生，1998，14(1):49.

［8］ 楊福江.玉米赤霉烯酮檢測方法比對研究［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2006，33(10):1824－1826.

［9］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中真菌毒素限量［S］.食品安全國家標準GB 2761－2011，2011.

［10］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量［S］.飼料衛(wèi)生標準GB 13078.2－2006，2006.