李育卿，魏玉輝，周 燕，王 丹，張 帆，武新安

(1.蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000；2.蘭州大學藥學院，蘭州 730000)

鏈脲佐菌素能夠快速而穩(wěn)定地選擇性破壞胰島β細胞功能，誘發(fā)大鼠實驗性糖尿病模型的常用藥物?？崭挂淮涡愿骨蛔⑸浯髣┝?50～70mg/kg)［1-4］的鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型是常常被用來評價評價降糖藥物藥效的手段?？疾焯悄虿游锍赡５闹笜艘话阋钥崭寡侵禐橐罁?，然而該模型對藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程是否和糖尿病病人一致少有報道。我們通過比較Niopas等［5］報道的健康受試者與Coppack等［6］報道的II型糖尿病患者口服格列本脲藥動學參數后發(fā)現(xiàn)，健康受試者和糖尿病人格列本脲的藥動學參數無明顯變化，這意味著格列本脲在健康受試者與II型糖尿病病人(無腎病)的體內過程無差異。本實驗試圖比較格列本脲在正常大鼠和一次性腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠模型的藥動學是否存在差異，并與文獻健康受試者和糖尿病人藥動學相比，研究此模型與II型糖尿病病人的藥動學是否一致，從而為確定鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠模型是否適合作為藥物的評價模型提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器

島津LC-20AT二元梯度泵，SPD-M20A二級陣列檢測器，DGU-20A在線脫氣系統(tǒng)，SL-20A自動進樣系統(tǒng)，CTO-20A柱溫箱，LC Solution色譜工作站(島津，日本)；SHZ-III型循環(huán)真空水泵(上海亞榮生化儀器廠)，高速離心機(深圳國華儀器廠)，XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)，LT-224S電子天平(北京賽多利斯)。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(Sigma公司，批號：18883-66-4)，格列本脲對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：10135-0103)，地西泮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：1230-960)，格列本脲片(山西云鵬制藥有限公司，批號：A081001)，甲醇(色譜純，德國默克公司)，乙腈(色譜純，山東禹王實業(yè)公司禹城化工廠)，其他試劑均為國產分析純。去離子水(蘭州大學第一醫(yī)院自制)。

1.3 動物

健康雄性W istar大鼠，體重200～250g，購于甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號SCXK(甘) 2004-0006。所有大鼠使用代謝籠單只喂養(yǎng)，自由飲水及給予標準化飼料。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件：色譜柱：伊利特 Hypersil ODS2(4.6mm ×150mm，5μm)，流動相：甲醇-0.2%乙酸溶液(57∶43，v/v)，流速：1m L/m in，柱溫：40℃，流檢測波長：229 nm，進樣量：20μL。

1.4.2 儲備液的配制：

1.4.2.1 內標溶液：精密稱取地西泮對照品適量置于100m L的容量瓶中，用乙腈定容至100m L，使地西泮濃度為0.205μg/mL，作為內標溶液。

1.4.2.2 格列本脲儲備液：精密稱取格列本脲對照品適量置于50m L的容量瓶中，用內標溶液配制成0.0852mg/m L的儲備液，置于4℃冰箱中保存，使用時用內標溶液稀釋至所需濃度。

1.4.3 血漿樣品處理：取血漿樣品100μL，加內標溶液200μL，旋渦振蕩2min，3500r/min離心10m in，將除蛋白后的溶液轉移至裝有30mg～50mg氯化鈉的1.5mL離心管中，渦旋振蕩1min，靜置吸取上層有機層，40℃水浴氮氣吹至少許，用乙腈溶解至50μL，超聲、混勻后取20μL進樣分析。

1.4.4 色譜行為：在上述色譜條件下，格列本脲的保留時間為 12.55min，內標的保留時間為 8.57 m in。內源性雜質不干擾格列本脲與內標的分離測定。圖1為空白血樣、加樣血漿及含內標的血漿樣品色譜圖。

圖1 HPLC色譜圖A-空白血漿；B-空白血漿+格列本脲標準品 +內標；C-正常大鼠灌胃給予10mg/kg后120min的血漿樣品；D-糖尿病大鼠灌胃給予10mg/kg后120min的血漿樣品；(1為內標，2為格列本脲)Fig.1 HPLC chromatograms of blood plasma of the ratsNote：A：Blank plasma；B：Blank plasma spiked with glibenclamide and internal standard；C：Nomal rat plasma collected at two hours after intragastrically administration of glibenclamide 10mg/kg；D：Diabetic rat plasma taken at two hours after intragastrically administration of glibenclam ide 10mg/kg；(1：internal standard；2：glibenclamide)

1.4.5 標準曲線制備和最低檢測濃度：精密吸取格列本脲對照品儲備液適量，用內標溶液稀釋至15.62、31.25、62.50、125.00、500.00、1000.00、1 500.00μg/L的系列對照品溶液。取上述對照品溶液200μL與100μL空白大鼠血漿混合按血漿樣品處理1.4.3項下操作，進樣分析。記錄格列本脲和內標峰面積。以格列本脲與內標的峰面積比為縱坐標(Y)，格列本脲的濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，回歸得方程為：Y=3.8771X+0.0378，r2= 0.9993。表明格列本脲在 15.62μg/L～1500.00μg/L范圍內，濃度與峰面積的線性關系良好。檢測限(S/N≥3)為3μg/L，血漿中格列本脲定量限(S/N≥10)為8μg/L。

1.4.6 精密度：配制高、中、低3種濃度(1000.00、125.00、31.25μg/L)三個不同濃度的格列本脲標準質控樣品，按血漿樣品處理1.4.3項下操作，進行色譜分析，代入標準曲線方程計算格列本脲濃度。一日內測定5次及每日測定1次，連續(xù)5d，計算日內日間精密度。日內精密度分別為3.72%，3.31%，4.58%。日間精密度分別為5.47%，9.12%，8.48%。

1.4.7 回收率：配制高、中、低(1000.00、125.00、31.25μg/L)三個不同濃度的格列本脲標準質控樣品，按血漿樣品處理1.4.3項下操作，進行色譜分析，代入標準曲線方程計算格列本脲濃度。將實測值與理論值相比得到相對回收率，高、中、低濃度的格列本脲在大鼠血漿中的平均回收率分別為(95.73±6.17)%、(102.58±4.55)%、(93.23± 3.07)%。

1.5 藥動學研究

1.5.1 造模及采集血樣：健康雄性W istar大鼠13只，(200～250)g，隨機分為兩組，即正常組5只和糖尿病組8只。糖尿病組大鼠禁食16h后腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg。72h后斷尾取空腹血，葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖。將空腹血糖高于16.7 mmol/L的大鼠視為造模成功，取5只納入實驗。給藥前禁食12h，自由飲水，灌胃給予格列本脲混懸液10mg/kg。于給藥前及給藥后15、30、60、90、120、150、180、240、360、540、720min，經股動脈插管采血0.25m L，同時補充等量含40IU/m L肝素鈉的生理鹽水，血樣立刻轉入涂過肝素鈉的1.5mL離心管中，在3500r/m in離心5m in得血漿，取血漿100μL在血漿樣品處理1.4.3項下操作，測定血藥濃度。

1.5.2 數據處理

血藥濃度測定結果用 Drug and Statistics of Windows 2.0(DAS 2.0)統(tǒng)計軟件進行處理，計算藥動學參數。正常組與模型組比較采取 t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥時曲線及與藥動學參數

圖2為格列本脲在正常組和模型組的藥-時曲線圖。由圖可以看出，糖尿病大鼠組格列本脲的血藥濃度高于正常大鼠組，且達峰時間延長。

圖2 灌胃給予格列本脲10mg/kg正常大鼠和糖尿病大鼠血藥濃度-時間曲線(±s，n=5)Fig.2 Mean plasma concentration-time curves of glibenclamide after intragastrically administrationin a dose of 10mg/kg in normal rats and diabetic rats(±s，n=5)

對藥時曲線中的數據用 DAS 2.0統(tǒng)計軟件進行處理，擬合后符合權重因子為1/CC的一室模型，主要的藥動學參數見表1。

3 討論

一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型常被用來研究藥物在糖尿病狀態(tài)下的藥動學和藥效學［1，4，7-9］。武開明［7］采用一次性腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，并比較了小檗堿在正常和糖尿病大鼠的藥動學，其結果表明，在糖尿病大鼠體內，小檗堿的Cmax和AUC(0～24h)與正常大鼠相比分別提高了1.3倍(P＜0.05)和1.5倍(P＜0.05)。劉曉等［8］采用相同方法制備糖尿病大鼠模型，經研究發(fā)現(xiàn)蘆丁在糖尿病腎病大鼠體內的AUC(0-t)與正常大鼠相比顯著增大(P＜0.01)，血漿清除率顯著減小(P＜0.05)。為了考察糖尿病對二甲雙胍藥動學的影響，本實驗室秦紅巖等人［10］采用空腹一次性腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，結果表明鹽酸二甲雙胍在糖尿病大鼠體內的Cmax、Tmax、t1/2及 AUC均顯著高于正常大鼠(P＜0.01)，其CL/F顯著低于正常大鼠(P＜0.01)。本課題結果表明格列本脲在正常大鼠和鏈脲佐菌素制備的糖尿病模型體內的藥動學存在顯著性差異。可見鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型對藥物的藥動學有較為顯著的影響。

表1 正常大鼠組和糖尿病大鼠組格列本脲主要藥動學參數(±s，n=5)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of glibenclamide in the normal and diabetic rats(±s，n=5)

表1 正常大鼠組和糖尿病大鼠組格列本脲主要藥動學參數(±s，n=5)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of glibenclamide in the normal and diabetic rats(±s，n=5)

注：Cmax，達峰血藥濃度；Tmax，血藥濃度達峰時間；CL，清除率；AUC(0～720min)，藥時曲線下面積。與正常組相比，*P＜0.05Note：Cmax：peak p lasma concentration；Tmax：time to reach Cmax；CL：total body clearance；AUC(0～720min)， area under the plasma concentration-time curve from time 0to 720min.Compared with the normal rats，*P＜0.05

參數Parameters正常大鼠組Normal rats糖尿病大鼠組Diabetic rats Tmax(min) 84.784±15.961 255.427±23.795* Cmax(μg/m L) 0.259±0.031 0.910±0.142* CL(L/min/kg) 0.092±0.012 0.019±0.008* AUC(0～720min)(mg/L·min) 57.752±18.932 321.24±130.374*

但是，Sambol等［11］比較了鹽酸二甲雙胍在健康受試者與II型糖尿病患者(無腎病)體內的藥動學，結果顯示健康受試者與糖尿病患者的所有藥動學參數無顯著差異。Niopas等［5］報道了健康受試者口服5mg/kg格列本脲的部分藥動學參數，如下：Tmax為 3.6 ±2.3 h，Cmax為167 ±63.4 ng/m L，AUC(0-24h)為808.6±279.4ng·h/m L。Coppack等［6］報道了II型糖尿病病人(無腎病無肝病)口服5mg/kg格列本脲的部分藥動學參數：Tmax為2.71±0.44h，Cmax為152±26ng/m L，AUC(0-24h)為1154±351ng·h/m L。通過比較兩組數據，格列本脲在健康受試者和II型糖尿病病人體內藥的藥動學參數也無顯著性差異。因此，藥物在一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型體內的藥動學變化和糖尿病患者體內藥動學的變化存在差異。

造成降糖藥物在糖尿病模型大鼠與正常大鼠體內藥動學參數存在差異而在 II型糖尿病病人和健康受試者體內藥動學參數無差異的原因，可能是由于一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型的病理機制與 II型糖尿病患者病理機制不同。鏈脲佐菌素能直接破壞胰島素β細胞，引發(fā)糖尿病癥狀，同時引起臟器損害，但其作用機制尚不明確［12］。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠胃排空減慢［13］可以導致格列本脲的吸收增加，從而使其AUC顯著增加。鏈脲佐菌素及高血糖環(huán)境能造成肝臟病變以及引起肝臟代謝酶的變化［14-15］。此外鏈脲佐菌素具有腎毒性，可抑制腎臟細胞的增殖和凋亡，引起細胞肥大，最終導致糖尿病腎?。?6-17］，引起體內藥物蓄積。體內肝臟及腎臟的損傷使格列本脲在糖尿病大鼠體內的總清除率下降。

因此，鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型可能不完全符合II型糖尿病的病理狀態(tài)。由本實驗室及他人的研究數據表明，鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型導致藥物的體內過程與正常大鼠明顯不同，與臨床實際情況出入較大，從而可能不適用于考察藥物在II型糖尿病病態(tài)下的藥動學研究。

［1］Eidi A，Eidi M，Esmaeili E. Antidiabetic effect of garlic (Allium sativum L.) in normal and streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Phytomedicine，2006，13(9-10)：624-629

［2］Akbarzadeh A，Norouzian D，Mehrabi MR，et al.Induction of diabetes by streptozotocin in rats［J］.Ind J Clin Biochem，2007，22(2)：60-64.

［3］Adikwu MU，Yoshikawa Y，Takada K. Pharmacodynamicpharmacokinetic profiles of metformin hydrochloride from a mucoadhesive formulation of a polysaccharide with antidiabetic property in streptozotocin-induced diabetic rat models［J］.Biomaterials，2004，25(15)：3041-3048.

［4］Nazaroglu NK，Sepici-Dincel A，Altan N.The effects of sulfonylurea glyburide on superoxide dismutase，catalase，and glutathione peroxidase activities in the brain tissue of streptozotocin-induced diabetic rat ［ J］. J Diabetes Complications，2009，23(3)：209-213.

［5］Niopas I，Daftsios AC.A validated high-performance liquid chromatographic method for the determination of glibenclamide in human plasma and its application to pharmacokinetic studies［J］.J Pharm Biomed Anal，2002，28(3-4)：653-657.

［6］Coppack SW，Lant AF，Mc Intosh CS，et al.Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of glibenclamide in non-insulin dependent diabetes mellitus［J］.Br J Clin Pharmacol，1990，29 (6)：673-684.

［7］武開明.葛根芩連湯中小檗堿在正常和糖尿病大鼠的藥動學比較［J］.中國藥師，2010，13(4)：467-468.

［8］劉曉，湯道權，印曉星，等.蘆丁在正常及糖尿病腎病大鼠體內藥代動力學研究［J］.徐州醫(yī)學院學報，2009，29(11)：708-712.

［9］Kalaiarasi P，Kaviarasan K，Pugalendi KV.Hypolipidemic activity of 18β-glycyrrhetinic acid on streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2009，612(1-3)：93-97.

［10］秦紅巖，段好剛，魏玉輝，等.鹽酸二甲雙胍在正常大鼠與糖尿病大鼠體內的藥動學比較［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2009，26(6)：433-436.

［11］Sambol NC，Chiang J，O'Conner M，et al.Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of methormin in healthy subjects and patients with noninsulin-dependent diabetes mellitus［J］. J Clin Pharmacol，1996，36(11)：1012-1021.

［12］夏旋.鏈脲佐菌素在糖尿病模型中的應用研究［J］.國際內科學雜志，2009，36(9)：540-543.

［13］Ishiguchi T，Tada H，Nakagawa K，et al.Hyperglycemia impairs antro-pyloric coordination and delays gastric emptying in conscious rats［J］.Auton Neurosci，2002，95(1-2)：112-120.

［14］Baig NA，Herrine SK，Rubin R.Liver disease and diabetes mellitus［J］.Clin Lab Med，2001，21(1)：193-207.

［15］Shimojo N，Ishizaki T，Imaoka S，et al.Changes in amounts of cytochrome P450isozymes and levels of catalytic activities in hepatic and renal microsomes of rats with streptozotocin-induced diabetes［J］.Biochem Pharmacol，1993，46(4)：621-627.

［16］Cruzado JM，Lloberas N，Torras J，et al.Regression of advanced diabetic nephropathy by hepatocyte growth factor gene therapy in rats［J］.Diabetes，2004，53(4)：1119-1127.

［17］原軍英.鏈脲佐菌素誘導大鼠糖尿病腎病模型研究進展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2009，38：66-68.