徐孝平，壽旗揚，陳方明，周衛(wèi)民，蔡月琴，陳民利

(1.浙江大學動物科學學院，杭州 310029；2.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的微血管并發(fā)癥，是由于DM引起的腎小球基底膜增厚，系膜擴張以及胞外基質(zhì)增生，導致腎小球的高濾過和蛋白尿［1］。2010版《中國2型糖尿病指南》指出目前我國20歲以上的成人DM的患病率在9.7%，而2型DM約占到95%，2001年國內(nèi)住院患者回顧分析顯示2型DM并發(fā)DN的患病率為34.7%，因此對2型DN的發(fā)病研究成為目前的熱點之一。目前國內(nèi)外研究建立的2型DN模型主要是應用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)加高脂飲食誘導，存在著造模時間長，模型穩(wěn)定性不足等問題。GK大鼠是1975年由Goto等人選育的與人類2型DM近似的自發(fā)性非肥胖2型糖尿病鼠種［2］，目前已有一些針對 GK大鼠腎臟改變的研究，但還存在著發(fā)病時間晚、癥狀不夠明顯的問題［3-6］。研究表明，由胰島素代謝障礙而致長期高血糖是DN發(fā)生的最關鍵原因［7］，飲食蛋白過高是糖尿病腎病的危險因素［8］，脂代謝紊亂亦是 DM和DN發(fā)生的一項獨立的危險因素［1］。本實驗通過給予GK大鼠高熱量高蛋白飲食，誘發(fā)GK大鼠形成高血脂高血糖，高蛋白尿，以期加快GK大鼠形成2型DN模型，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性GK大鼠28只，28周齡，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［SCXK(滬)2007—0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障動物實驗設施［SYXK(浙)2008—0115］，室溫(23±2)℃，相對濕度60% ～70%。

1.2 試劑

尿微量白蛋白(U-ALB)檢測試劑盒、尿蛋白(U-TP)檢測試劑盒、肌酐(Cr)檢測試劑盒、尿素氮(BUN)檢測試劑盒、血糖(GLU)檢測試劑盒、總膽固醇(TC)檢測試劑盒、甘油三脂(TG)檢測試劑盒由上海申能-德賽診斷技術有限公司提供；鈉鉀ATP酶(Na+K+-ATPase)檢測試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所有限公司提供。

1.3 實驗儀器

7 020全自動生化分析儀(日本日立)，BT-815A半自動生化分析儀(上海三科儀器有限公司)，AG204電子分析天平(瑞士Mettler)，HM 335E型輪轉(zhuǎn)切片(德國Microm)，染色機(德國Leica)，AP280組織包埋機(德國Microm)，脫水機(德國Microm)，顯微鏡(德國Zeiss)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及2型DN模型的建立：動物隨機分成模型組、對照組，每組各12只。模型組給予高熱量高蛋白飼料(飼料組成：基礎飼料59.75%，酪蛋白19%，豬油10%，蔗糖10%，膽固醇1%，3號膽鹽0.25%，蛋白質(zhì)∶脂肪∶碳水化合物熱量比為28.3∶28.3∶44.3)；對照組給予基礎飼料(蛋白質(zhì)∶脂肪∶碳水化合物熱量比為24.6∶12.5∶62.9)，由浙江省醫(yī)學科學院配制提供，共飼養(yǎng)8周。根據(jù)Mogensen［9］對DN的分期標準判定 GK大鼠糖尿病腎病的發(fā)生。

1.4.2 指標觀察；

1.4.2.1 動物一般狀況：每日觀察大鼠飲食飲水、精神狀態(tài)、活動情況、大便性狀、每周測體重并記錄。

1.4.2.2 尿液生化指標：各組于第0、4、8周上代謝籠，測定24h尿量，并取尿液離心取上清液檢測UALB、U-TP、U-Cr水平，并計算24h U-ALB、24h UTP、U-ALB/U-Cr比值。

1.4.2.3 血液生化指標：各組于第0、8周，禁食不禁水10h，取血分離血清，檢測空腹血糖(FBG)和血清肌酐(Scr)、BUN、TC、TG、NO水平。NO采用硝酸還原酶法測定，使用半自動生化儀檢測。

1.4.2.4 腎重指數(shù)：各組大鼠稱取體重，末次取血后，取雙側(cè)腎臟，去除腎包膜，稱重，計算腎重指數(shù)，腎重指數(shù)=雙側(cè)腎重/體重‰。

1.4.2.5 組織病理學指標：腎組織用4%中性甲醛溶液固定24h后，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，進行HE染色和 PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理學變化，根據(jù) Tervaert等［10］發(fā)布的DN病理分型標準判斷GK大鼠腎臟的病變程度。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計，用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性界值。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察和體重變化

兩組大鼠在實驗過程中均未有死亡，對照組動物精神狀況略優(yōu)于模型組，模型組大鼠體重增長略快于對照組，但差異未有顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 24h尿微量白蛋白、24h尿蛋白、尿微量白蛋白與尿肌酐比值的動態(tài)變化

與對照組相比，模型組的第0周24h-U-ALB水平、24h-U-TP水平和U-ALB/U-Cr比值差異無顯著性(P＞0.05)，第4、8周時各指標水平都顯著升高(P＜0.01)；與第0周相比，模型組大鼠第4、8周24h U-ALB水平、24h-U-TP水平和U-ALB/U-Cr比值顯著升高(P＜0.01)，對照組大鼠第4、8周24h-UALB水平顯著升高(P＜0.01)，24h-U-TP水平無顯著差異(P＞0.05)，U-ALB/U-Cr比值水平顯著升高(第4周P＜0.05，第8周P＜0.01)。見圖1。

2.3 腎肥大指數(shù)和腎組織鈉鉀ATP酶活性的比較

與對照組相比，模型組大鼠腎肥大指數(shù)顯著升高(P＜0.01)，模型組大鼠腎組織鈉鉀ATP酶活性顯著升高(P＜0.01)。見圖2。

2.4 空腹血糖、一氧化氮、腎功能、血脂水平的變化

圖1 兩組大鼠24h尿微量白蛋白、24h尿蛋白、尿微量白蛋白與尿肌酐比值的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of 24h-U-ALB，24h-U-TP and U-ALB/Ucr in the two groups of rats.注：與對照組比較，＊＊P＜0.01；與第0周比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note：Compared with the control group，＊＊P＜0.01；Compared with week 0，P＜0.05，△△P＜0.01

圖2 兩組大鼠腎肥大指數(shù)和腎組織鈉鉀ATP酶活性的比較Fig.2 Comparison of kidney hypertrophy index and Na+K+-ATPase activity in the two groups of rats.注：與對照組比較，＊＊P＜0.01.Note：Compared with the control group，＊＊P＜0.01

與對照組相比，模型組第0周的FBG、NO、Scr、BUN、TC、TG水平差異無顯著性(P＞0.05)，第8周的FBG、NO、TC、TG水平差異有顯著性(P＜0.01)，Scr、BUN水平差異無顯著性(P＞0.05)；與第0周相比，模型組第8周的FBG、NO、TC、TG水平差異有

顯著性(P＜0.01)，Scr、BUN水平差異無顯著性(P＞0.05)，對照組第8周的NO水平差異有顯著性(P＜0.01)，其余指標水平差異均無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.5 腎臟組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小球未見明顯增大，系膜細胞未見明顯增多，模型組大鼠腎臟體積增大，腎小球囊腔狹窄，球內(nèi)細胞增多，可見部分腎小管成上皮管型。PAS染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎小球系膜基質(zhì)稍增多，基底膜增厚，模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜區(qū)增寬，PAS染色陽性區(qū)域成團塊狀。根據(jù)Tervaert等發(fā)布的DN病理分型標準，對照組大鼠腎臟病變有9例為IIa型、3例為IIb型；模型組大鼠腎臟病變有2例為IIa型、9例為IIb型、1例為III型(圖3，見彩插6)。

3 討論

DN發(fā)病機制比較復雜，至今尚不完全清楚，除遺傳因素、高血糖相關代謝紊亂以外，還與血脂異常、飲食中蛋白和脂肪攝入的數(shù)量、高血壓、精神等多因素有關［11］。研究2型 DN需先建良好的2型DM模型，目前國內(nèi)常用小劑量 STZ加高脂飲食誘導2型DM，國外2型DM研究多采用具有自發(fā)性糖尿病傾向的近交系動物，如db/db小鼠、OLETF大鼠、肥胖型Zuker大鼠、GK大鼠等。小劑量STZ加高脂飲食誘導的2型DN模型忽略了DN發(fā)病的遺傳因素，還存在造模時間偏長，穩(wěn)定性不足的問題；通過自發(fā)生2型DM模型引起2型DN，只考慮遺傳因素在發(fā)病過程中的主導作用，這與臨床并不完全相符，且成模時間也長。

GK大鼠主要表現(xiàn)為胰島素分泌受損，葡萄糖負荷后胰島素釋放異常，肝臟、肌肉和脂肪組織中度胰島素抵抗等。GK大鼠的血糖隨著年齡增長而升高，繼而出現(xiàn)腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，腎臟組織學改變主要包括腎小球基底膜增厚，腎小球膜基質(zhì)增多，腎小球增生等［2］，在長期糖尿病后，GK大鼠出現(xiàn)腎小球肥大，局灶性腎小球硬化，腎小管間質(zhì)纖維化，炎癥細胞浸潤等形態(tài)學變化［12］。但目前的研究顯示，GK大鼠的高血糖因素在主導糖尿病腎病發(fā)展上存在著發(fā)病時間晚，癥狀不夠明顯的問題。本實驗通過運用GK大鼠，結(jié)合 DN發(fā)病過程中遺傳因素、長期高血糖、飲食蛋白和脂肪攝入等各種因素，以期建立更與人類疾病相似的2型 DN模型。

表1 兩組大鼠體重、空腹血糖、一氧化氮、腎功能、血脂水平的變化Tab.1 Changes of body weight，F(xiàn)BG，NO，Scr，BU，、TC，and TG in the two groups of rats

本實驗發(fā)現(xiàn)，8周后模型組大鼠FBG、TG、TG水平顯著高于對照組，模型組的2型糖尿病癥狀更加明顯。臨床上以24h-U-ALB作為早期診斷DN的金指標，目前的研究表明U-ALB/U-Cr比值亦有很高的診斷價值［13］，本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組24h-U-ALB、U-ALB/U-Cr比值、24h-U-TP亦顯著高于對照組，且隨著實驗時間的延長而加重，Mogensen的DN分期標準指出，尿白蛋白排泄率(uAE)在30～300mg/24h為早期 DN期，uAE＞300mg/24h為顯性 DN期，按體重折算成大鼠這兩期uAE指標分別為0.2～2mg/24h和2mg/24h，結(jié)果表明，模型組大鼠基本處在顯性DN期。糖尿病腎臟肥大是出現(xiàn)最早、最明顯的腎臟病理改變，而腎重指數(shù)是衡量腎臟肥大較客觀的指標，模型組大鼠腎重指數(shù)明顯高于對照組，病理檢查顯示，腎臟體積增大，腎小球囊腔狹窄，球內(nèi)細胞增多，基底膜明顯增厚，系膜區(qū)增寬，根據(jù)Tervaert的DN病理分型標準，模型組大鼠腎病病理分型基本在 IIb型，與非病理指標判斷基本相符，表明模型已誘導成功。研究表明體內(nèi)高血糖狀態(tài)下，激活與醛糖還原酶相關的多元醇通路，造成進入腎組織細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰淄高^細胞膜的山梨醇和果糖，在細胞內(nèi)堆積而造成細胞腫脹和破壞，并促進大分子糖化終末產(chǎn)物形成，造成腎小球基底膜增厚［14］，且能促使蛋白激酶 C活性升高，引起細胞黏附因子在腎小球膜細胞中的表達，加速腎小球損傷，高血糖致血容量擴張，從而使腎血流量增加，造腎小球濾過率升高，促進DM向DN的轉(zhuǎn)變。血脂異常導致腎臟損傷的可能機制有腎小球基底膜脂質(zhì)沉積，刺激基底膜細胞增殖和細胞外間質(zhì)生成，降低纖溶活性，造成腎小球毛細血管的血栓栓塞，改變血管阻力使腎小球呈高濾狀態(tài)，尿白蛋白排出增加等。實驗中，模型組腎功能與對照組并無差異，考慮可能和病程較短有關，還未達到DN晚期。研究表明，NO的升高導致腎小球毛細血管的高灌注、高濾過，從而增加腎的工作負荷，促使DN的惡化［15］；在STZ誘導的DM大鼠早期，腎組織Na+K+-ATPase活性明顯增強，與DN的發(fā)生發(fā)展有顯著的相關性［16］。本實驗顯示，模型組的腎組織Na+K+-ATPase的活性和血清NO顯著升高，進一步加劇了GK大鼠向2型DN的進展。

［1］王戰(zhàn)建.糖尿病腎病發(fā)病機制的研究進展［J］.國際泌尿系統(tǒng)雜志，2006，26(5)：693-696.

［2］王芬，何華亮，劉銅華，等.自發(fā)的2型糖尿病動物模型［J］.中國實驗動物學報，2007，15(5)395-398.

［3］Phillips AO，Baboolal K，Riley S，et al.Association of prolonged hyperglycem ia with glomerular hypertrophy and glomerular basement membrane thickening in the Goto Kakizaki model of non-insulin-dependent diabetes melltitus［J］.Am J Kidney Dis，2001，37：400-410.

［4］Cheng ZJ，Vaskonen T，Tikkanen I，et al. Endothelial dysfunction and salt-sensitive hypertension in spontaneously diabetic Goto-Kakizaki rats［J］.Hypertension，2001，37：433-439.

［5］Sato N，Komatsu K，Kurumatani H.Late onset of diabetic nephropathy in spontaneously diabetic GK rats［J］.Am J Nephrol，2003，23：334-342.

［6］Sehrijvers BF，De Vriese AS，Van de Vorde J，et al.Long-term renal changes in the Goto-Kakizaki rat，a model of lean type 2diabetes［J］.Nephrol Dialysis Transpl，2004，19：1092-1097.

［7］李景麗.對糖尿病腎病危險因素的研究進展［J］.廣西中醫(yī)學院學報，2009，12(2)：81-83.

［8］Hansen HP，Tauber LE，Jensen BR，et al.Effect of dietary protein restriction on prognosis in patients with diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2002，62：220-228.

［9］Mogensen CE.Microalbuminuria as a predictor of clinical diabetic nephropathy［J］.Kidney Int.1987，31(2)：673-89.

［10］Tervaert TW，Mooyaart AL，Amann K，et al.Pathologic classification of diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol.2010，21(4)：556-563.

［11］Jorge LG，Mirela JA，Sandra PS，et al.Diabetic nephropathy：diagnosis，prevention，and treatment［J］.Diabetes Care，2005，28：164-176.

［12］劉毅，王宗保.糖尿病腎病動物模型的研究進展［J］.中國實驗動物學報，2006，14(1)：67-70.

［13］孔建新，姚麗娟，羅以勤，等.多項生化檢測指標對診斷早期糖尿病腎病的價值［J］.安徽醫(yī)學，2009，30(4)：380-381.

［14］Jensen LJ，Stergaard J，F(xiàn)lyvbjerg A.AGE-RAGE and AGE cross-link interaction：important p layers in the pathogenesis of diabetic kidney disease［J］.Horm Metab Res，2005，37：26-34.

［15］李凝，陸付耳，董慧，等.小檗堿對糖尿病大鼠早期腎臟高濾過狀態(tài)的干預作用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，17 (4)：192-196.

［16］Scherzer P，Popovtzer MM.Segmental localization of mRNAs encoding Na+-K+-ATPase α1-and β1-subunits in diabetic rat kidneys using RT-PCR［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，282(3)：F492-F500.