李鳳鳴 譚秀山 許先查 王 鶴

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；

2.新疆職業(yè)大學(xué)烹飪與餐飲管理學(xué)院，烏魯木齊 830013）

“紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用”實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

李鳳鳴1譚秀山2許先查1王 鶴1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；

2.新疆職業(yè)大學(xué)烹飪與餐飲管理學(xué)院，烏魯木齊 830013）

試驗(yàn)比較研究了13種展層劑對(duì)氨基酸的分離效果并驗(yàn)證了其在酶促轉(zhuǎn)氨基試驗(yàn)中對(duì)氨基酸的分離效果。結(jié)果表明展層劑無(wú)水乙醇-水-尿素（80：20：0.5，V/V/W）氨基酸分離效果明顯，且無(wú)毒害作用，能夠替代傳統(tǒng)試驗(yàn)中水飽和酚。

展層劑 氨基酸 紙層析

“紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用”試驗(yàn)中分離氨基酸時(shí)常用的展層劑是水飽和苯酚[1]（水：酚=1：2，v/v），但苯酚揮發(fā)性大，具有強(qiáng)烈的刺激氣味，對(duì)皮膚、呼吸道有腐蝕作用，危害教師及學(xué)生的身體健康。人們也在不斷嘗試新的安全且分辨效果好的展層劑，用于替代水飽和苯酚，但其效果在試驗(yàn)中表現(xiàn)參差不齊。本文總結(jié)了近10年文獻(xiàn)報(bào)道中用于氨基酸分離的13種展層劑并對(duì)其分離氨基酸的效果進(jìn)行了試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 展層劑的篩選試驗(yàn)

1.1.1 展層劑的篩選

根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)，我們選擇了相應(yīng)的展層劑進(jìn)行篩選。展層劑的組成見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑 1%（w/v）谷氨酸溶液、1%（w/v）丙氨酸溶液以及谷、丙氨酸混合溶液。

1.1.3 濾紙 將層析濾紙剪裁為5cm× 16cm，備用。

1.1.4 顯色劑 0.1%（W/V）茚三酮的乙醇溶液。

1.1.5 步驟 采用周順伍主編《動(dòng)物生物化學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)》中紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用中的上行法。

1.2 展層劑在紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用中的應(yīng)用

根據(jù)1.1展層劑的篩選試驗(yàn)的結(jié)果，選擇分離效果明顯的展層劑用于紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用，以驗(yàn)證展層劑展層效果。

試驗(yàn)方法及步驟參見(jiàn)周順伍主編《動(dòng)物生物化學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)》。

1.2.1 酶液制備，取新鮮肝臟5 g，加0.9%NaCl溶液1 ml，在乳缽中研磨，再加0.9%NaCl溶液1 ml，繼續(xù)研磨成勻漿，最后加入0.9%NaCl溶液5 ml混勻，3 000 r/min，5 min離心，取上清液，即為肝臟糜提取液（含有轉(zhuǎn)氨酶）。

1.2.2 取2支試管分別編號(hào)為1、2，分別加入20滴肝臟糜提取液，并將1號(hào)管在沸水浴中煮沸2 min，以破壞酶活。再分別加入10滴1%谷氨酸溶液、10滴1%丙酮酸溶液、10滴0.1%KHCO3溶液和5滴0.25%溴乙酸溶液，混勻，37°C水浴1 h后加入4滴2%醋酸溶液搖勻并水浴加熱至蛋白質(zhì)全部沉淀。分別用濾紙過(guò)濾，濾液備用。

1.2.3 層析方法同1.1。

1.3 Rf值的計(jì)算：按下式計(jì)算氨基酸的Rf值

Rf=原點(diǎn)到層析樣品點(diǎn)中心的垂直距離／原點(diǎn)到溶劑最前沿的垂直距離

2 結(jié)果與討論

2.1 展層劑篩選的試驗(yàn)結(jié)果

13種展層劑篩選的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知3號(hào)、10號(hào)以及13號(hào)展層劑均能夠?qū)被岱蛛x，且谷、丙氨基酸分離效果明顯；分離時(shí)間分別為57 min、72 min、69 min。

表1 展層劑的組成

表2 展層劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果

表3 紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用的試驗(yàn)結(jié)果

2.2 紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用的驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用后，氨基酸在各種展層劑中的遷移率見(jiàn)表3。

由表3可以看出，3、10、13號(hào)展層劑均能有效分離將氨基酸分離，3號(hào)、10號(hào)以及13號(hào)展層劑中谷氨酸、丙氨酸Rf的差值分別為0.26、0.21、0.36，展層時(shí)間分別為60 min、68 min、75 min。Rf的差值越大，分離效果越明顯。3號(hào)展層劑的分離效果明顯優(yōu)于10號(hào)，但不及13號(hào)展層劑，但在分離時(shí)間上3號(hào)展層劑的展層時(shí)間最短。

從展層效果以及展層時(shí)間綜合考慮，3號(hào)展層劑即無(wú)水乙醇∶水∶尿素（80∶20∶0.5，v/v/w）、10號(hào)展層劑即無(wú)水乙醇∶冰乙酸∶水（50∶1∶10，v/v/v）均能夠替代13號(hào)展層劑水飽和苯酚溶液用于分離氨基酸，但3號(hào)展層劑替代效果優(yōu)于10號(hào)展層劑。

3 結(jié)論

試驗(yàn)證明，無(wú)水乙醇、水、尿素（80∶20∶0.5，V/V/W）能夠有效的替代水飽和酚作為展層劑，并且氨基酸分離效果明顯，層析試驗(yàn)時(shí)間明顯縮短，且無(wú)毒害作用。

[1] 周順伍主編.動(dòng)物生物化學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：92-97.

[2] http：//class.htu.cn/swhx/syjx/210.htm.

[3] 李正文，方小健，焦鴻俊，等.紙層析分離轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)物方法的改進(jìn)[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，17：27-29.

[4] 傅力明，張愛(ài)萍，溫寶珍.氨基酸在紙層析中的分離[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19（4）：384.

[5] 游力書(shū)，范俊源，賈永輝.氨基酸紙層析和紙電泳分析的新改進(jìn)[J].化學(xué)通報(bào)，1994，（3）：34.

[6] 邱昌恩，朱曉慶，董紅兵.關(guān)于“氨基酸的分離鑒定——紙層析法”的試驗(yàn)方法改進(jìn)研究[J].湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），19（3）：87-88.

[7] 叢峰松主編.生物化學(xué)試驗(yàn)[M].上海交通大學(xué)出版社，2005，6.

[8] 周麗華，馮道全，倪惠瓊.氨基酸紙上層析方法的研究[J].安徽理工大學(xué)學(xué)報(bào).2003，23（1）：47-49.

[9] 黃汝騏，郭佃順，王廣磊，等.氨基酸紙上層析試驗(yàn)的改進(jìn)[J].山東師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，13（4）：476-477.

[10] 邵軍.氨基酸紙上層析試驗(yàn)的改進(jìn)[J].菏澤師專學(xué)報(bào)，2000，22（4）：76-79.

[11] 楊曉玲，趙宗云，劉永軍，等.應(yīng)用紙層析分離鑒定氨基酸方法的改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38（4）：368.

[12] 張慶云,王景華,鄧桂茹,等.紙層析試驗(yàn)中“偏離”現(xiàn)象的研究[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998，7(1)：28-29.

[13] 陳志慧.氨基酸分析技術(shù)的綜述[J].廣東化工,2004,(2)：69-71.

[14] 呂春梅.生物化學(xué)及生態(tài)學(xué)試驗(yàn)技術(shù)[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2004.