尹 茶，吳婷婷，朱東亮，劉職瑞，柴逸峰(.第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，上海004;.解放軍6醫(yī)院藥械科，北京049;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，上海004)

知母為百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、生津潤燥的功能。臨床用于外感風(fēng)寒，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明知母中的甾體皂苷具有多種的藥理活性，包括:抑制血小板的聚集［2］、清除自由基［3］、降血脂［4］，抗腫瘤［5］，抑制Na+-K+-ATP酶［6］以及改善認(rèn)知功能、提高學(xué)習(xí)記憶能力［7］等作用。知母中所含甾體皂苷種類較多，水解后的苷元主要是菝葜皂苷元(sarsasapogenin)，2000年及以前藥典以菝葜皂苷元含量作為指標(biāo)，反映總皂苷的含量。此法雖可作為知母藥材基本的質(zhì)量控制方法，但是僅能間接反映總皂苷的含量。而且水解的過程改變了藥材中成分的原有組成，操作也相對繁瑣。因此直接測定藥材中主要皂苷的含量應(yīng)該更能反映藥材的質(zhì)量狀況。知母藥材中皂苷的含量測定已有一些報(bào)道［8～10］，包括單獨(dú)測定知母BⅡ和同時(shí)測定幾種知母皂苷，但測定時(shí)間都較長。此外同時(shí)對中藥中多成分的測定，還要保證方法的快速、簡便、廣泛，從而提高方法的適用性和實(shí)用性。因此本文建立了同時(shí)測定知母藥材中知母皂苷B、知母皂苷E1、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的HPLC-ELSD方法，該法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，且具有足夠的靈敏度，可為知母藥材的品質(zhì)評價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

WATERS 510型雙泵;996 PDA檢測器;Rheodyne 7725i進(jìn)樣器;法國SEDEX 75型蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD);柱后連接PDA，再與ELSD采用串連方法連接;WATERS Empower pro色譜工作站; SrA3dv色譜數(shù)據(jù)工作站;ORION MODEL 828型pH計(jì);METTLER AE240電子天平;BRANSON SB3200-T型超聲儀。

知母生藥材均由本校生藥教研室陳萬生教授采集鑒定為百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。并按照《中國藥典》2010版一部規(guī)定進(jìn)行干燥，切片，粉碎，過40目篩，60℃干燥至恒定質(zhì)量等預(yù)處理。知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII對照品由本校生藥教研室制備;乙腈為色譜純(Fisher公司)，冰醋酸為分析純(上海精細(xì)科技研究所)，水為去離子水，其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm，Agilent);流動(dòng)相:A相為水(冰醋酸調(diào)節(jié)pH 3.3)，B相為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～8 min，12%～23%B;8～25 min，23%B; 25～35 min，23%～45%B;35～40 min，45%～95% B;流速:1.0 ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10 μl。進(jìn)樣前以流動(dòng)相初始梯度平衡10 min。檢測器漂移管溫度55℃，蒸發(fā)溫度70℃，蒸發(fā)光散射檢測器以氮?dú)鉃殪F化氣，壓力為4.0 Bar。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取知母皂苷B、知母皂苷 BII、知母皂苷 E1對照品4.21、19.22、4.88 mg，以70%乙腈溶解，定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備溶液。另精密稱取知母皂苷AIII對照品5.32 mg，以70% 乙腈溶解，定容于25 ml量瓶中，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備溶液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 樣品溶液的制備 取知母藥材粉末0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，稱重，加入50 ml 80%甲醇，超聲45 min，以80%甲醇補(bǔ)足重量后濾紙直接過濾，再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 在2.1項(xiàng)的色譜條件下，以對照品溶液和樣品進(jìn)樣，根據(jù)色譜參數(shù)計(jì)算系統(tǒng)適應(yīng)性。理論塔板數(shù)以知母皂苷E1計(jì)算大于14 000;以知母皂苷BII計(jì)算大于15 000;以知母皂苷B計(jì)算大于25 000;以知母皂苷AIII計(jì)算大于60 000;待測物峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合含量測定要求。對照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)溶液的HPLC-ELSD色譜圖1-知母皂苷B;2-知母皂苷E1;3-知母皂苷BII;4-知母皂苷AIII

2.3.2 線性關(guān)系 精密吸取對照品混合溶液逐級(jí)用70%乙腈減半稀釋，得5個(gè)濃度梯度的對照品混合溶液(知母皂苷 B依次為:42.10、84.20、168.4、210.5、252.6 μg/ml，知母皂苷E1依次為:49.80、 97.60、195.2、244.0、292.8 μg/ml，知母皂苷BII依次為:192.2、384.4、768.8、961.0、1 153 μg/ml，知母皂苷AIII依次為8.512、17.02、34.05、42.56、85.12 μg/ml。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程知母皂苷B在42.10～252.6 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.507 6X+2.995 5(r=0.999 3);知母皂苷E1在48.80～292.8 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y= 1.494 6X+2.593 3(r=0.999 1);知母皂苷BII在192.2～1 153 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.329 0X +2.957 4(r=0.999 7);知母皂苷A III在8.512～85.12 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.381 7X+ 3.662 2(r=0.998 5)。

2.3.3 精密度 在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別以對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面積積分值RSD分別為0.35%、0.29%、0.79%、0.46%，符合含量測定要求。

2.3.4 穩(wěn)定性 精密稱取產(chǎn)地為山東濟(jì)南的知母藥材粉末0.8 g，照2.2.2項(xiàng)下的方法制備樣品溶液。分別在0、3、6、12、18、24、26、48 h測定4種有效成分的峰面積，計(jì)算其RSD，結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面積積分值RSD分別為0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量測定要求。

2.3.5 重復(fù)性 精密稱取批號(hào)為H2011080502的知母藥材粉末5份各約0.8 g，按照2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測定4種有效成分的含量，計(jì)算其RSD。結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷 AIII含量的 RSD分別為 0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量測定要求。

2.3.6 最低檢測限 經(jīng)一系列稀溶液測定，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII的最低檢測限分別為4.9、5.5、6.2、3.7 μg/ml。

2.3.7 加樣回收率 取批號(hào)為H2011080502的知母藥材粉末約0.8 g，精密稱定，其中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII含量分別是7.079 6、50.981 5、6.064 9、0.827 7 mg/g，分別精密加入適量的對照品溶液，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測定4種有效成分的含量，結(jié)果其平均加樣回收率為102.8%、96.04%、97.27%、98.15%;其RSD分別為1.11%、0.46%、1.06%、3.24%，結(jié)果表明此方法的準(zhǔn)確性良好，符合含量測定的要求。

2.4 樣品含量測定 取不同產(chǎn)地知母藥材，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測定4種皂苷成分的含量，每份供試品溶液重復(fù)測量3次，取其平均值作為各產(chǎn)地藥材的成分含量。結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地知母藥材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

表1 不同產(chǎn)地知母藥材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

AIII H2011073101 河北易縣 1.435±0.063 9.754±0.033 63.02±0.082 0.6578批號(hào) 產(chǎn)地 知母皂苷B 知母皂苷E1 知母皂苷BII 知母皂苷±0.0035 H2011080502 河北易縣 2.392±0.087 15.55±0.071 63.05±0.131 2.053±0.009 H2011081904 河北赤城 1.160±0.077 11.15±0.083 56.52±0.074 0.7754±0.0018 H2011100901 河北赤城 3.897±0.034 9.679±0.054 56.82±0.129 0.8525±0.0021 H2011010903 河北陽原 6.346±0.036 9.292±0.017 67.31±0.051 0.4633±0.0019 H2010081601 河北陽原 4.265±0.025 10.57±0.080 58.47±0.110 0.9916±0.0033 A2009080303 安徽亳州 15.68±0.031 7.226±0.076 39.09±0.033 1.541±0.005 H2012030609 湖南長沙 4.223±0.032 7.753±0.045 49.78±0.175 2.186±0.007 L2012010402 遼寧丹東 4.981±0.044 8.052±0.039 54.55±0.117 1.263±0.008 S2011080901 山東濟(jì)南 5.144±0.029 7.080±0.041 52.15±0.194 2.721±0.013 S2011060703 山東青島 6.065±0.018 7.770±0.029 50.98±0.096 0.8277±0.0041 Z2011051201 浙江溫州 8.721±0.064 7.873±0.013 48.16±0.141 1.100±0.006 H2012031801 河南新鄉(xiāng) 7.042±0.085 8.169±0.037 43.05±0.071 1.356±0.012

3 討論

3.1 樣品前處理方法優(yōu)化 對知母藥材樣品溶液的制備，有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，采用80%乙醇提取效果最好，本實(shí)驗(yàn)對比了不同提取方法(超聲、回流、索氏提取)、不同提取溶劑(100%甲醇、80%甲醇、80%乙醇)對知母藥材的提取效果，結(jié)果采用索氏提取與回流的效果相差不大，超聲的提取效率顯著高于前兩者，且采用80%甲醇超聲的提取效果較80%乙醇和100%甲醇要好得多。綜合經(jīng)濟(jì)實(shí)用、快捷簡便等各個(gè)方面，故確定最終的提取條件采用80%甲醇50 ml，超聲處理45 min。這樣既可把其中有效成分盡可能多的提取出來，又可節(jié)約時(shí)間，方便操作。

3.2 色譜條件優(yōu)化 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別使用甲醇－水系統(tǒng)以及乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)獲得的總的分離度大于甲醇-水系統(tǒng)，故選擇乙腈-水系統(tǒng)作為基礎(chǔ)的流動(dòng)相，同時(shí)發(fā)現(xiàn)降低流動(dòng)相的pH值有助于改善色譜峰峰型及優(yōu)化分離，故向流動(dòng)相中加入一定比例的冰醋酸。知母皂苷B、E1、BII為呋甾皂苷，知母皂苷AⅢ為螺甾皂苷，兩類皂苷極性相差較大，用等度洗脫無法同時(shí)保證4種皂苷的合適保留時(shí)間和較好的分離。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，采用水(醋酸調(diào)至pH 3.3)和乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，使極性較大的呋甾皂苷不致出峰過早，極性較小的螺甾皂苷也不會(huì)因保留時(shí)間過長而峰形展寬，4個(gè)成分均能夠分離良好，保障了測定的準(zhǔn)確性。

3.3 ELSD工作參數(shù)的確定 在ELSD實(shí)驗(yàn)中，為了獲得更高的靈敏度，需要調(diào)節(jié)載氣壓力和漂移管溫度這2個(gè)最關(guān)鍵的儀器參數(shù)。它們的通用參數(shù)為載氣壓力(3.5 Bar)和漂移管溫度(40℃)，但在本梯度條件下，由于實(shí)驗(yàn)采用了乙腈-水系統(tǒng)，初始梯度含有高比例的水，色譜圖中會(huì)由于溶劑的揮發(fā)不完全而導(dǎo)致毛刺峰的產(chǎn)生，通過對儀器的通用參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，逐漸提高載氣壓力，當(dāng)載氣壓力到達(dá)至4.0 Bar時(shí)，色譜圖中的毛刺峰基本消失，再增加載氣壓力，不能得到更優(yōu)化的結(jié)果，在此載氣條件下逐漸調(diào)節(jié)漂移管溫度，當(dāng)溫度逐漸上升時(shí)，色譜圖中毛刺峰也有一定的優(yōu)化，當(dāng)設(shè)為55℃后，基本達(dá)到最佳。故最終確定的ELSD檢測參數(shù):漂移管溫度55℃;載氣壓力4.0 Bar。另外，設(shè)定增益值為7，可以使信號(hào)相應(yīng)較高，且基線的噪音不會(huì)對檢測產(chǎn)生任何影響。特別值得注意的是，由于ELSD獨(dú)特的散射光檢測原理，物質(zhì)的響應(yīng)與濃度不成線性關(guān)系，而是對數(shù)關(guān)系，在制定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，對峰面積以及樣品濃度均采用雙對數(shù)進(jìn)行運(yùn)算，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線也不會(huì)經(jīng)過原點(diǎn)，在進(jìn)行樣品含量測定時(shí)，也采用同樣的計(jì)算方式。

3.4 藥材之間的質(zhì)量差異 對13個(gè)不同產(chǎn)地(批號(hào))的知母藥材測定結(jié)果表明，與文獻(xiàn)中知母皂苷含量在6%左右的結(jié)果相符，但藥材中所含的4種皂苷，其含量間的差異較大，其中以知母皂苷B的含量差異最大，安徽亳州產(chǎn)地的(A2009080303)與河北赤城產(chǎn)地的(H2011081904)相差高達(dá)13.52倍，其他成分的含量最大與最小含量之間差異在1.62～5.87倍不等。雖然單個(gè)成分的差異較大，但藥材中總皂苷的含量差別相對較小，僅為1.37倍，充分說明在藥材種植過程中，由于影響藥材生長的諸多因素等的作用，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生不同變化，也證明需要具體分析藥材中的活性成分的含量，而一般僅僅水解皂苷，分析菝葜皂苷元的做法或者僅僅測定其中的紫外吸收部位對知母的質(zhì)量控制是不完全的，本文建立的色譜方法能夠?qū)χ杆幉淖鞲訃?yán)格的質(zhì)量控制，從而能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究知母活性成分的藥理藥效提供基礎(chǔ)。

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