劉鴻越，江 鍵，馬 琳，梁媛媛，董法杰，崔黎麗(第二軍醫(yī)大學(xué)，.藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室;.基礎(chǔ)部數(shù)理教研室，上海200433)

大分子量的肽和蛋白質(zhì)類藥物的特殊理化性質(zhì)決定了其很難透過皮膚屏障，限制了其在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用［1］。駐極體是一類能夠長期儲存空間電荷和(或)偶極電荷的功能電介質(zhì)材料［2］。它的靜電效應(yīng)和微電流能改變皮膚角質(zhì)層內(nèi)的脂質(zhì)雙層排列方式，形成大量暫時的、可滲透的新孔道［3］。研究表明，駐極體對小分子藥物有良好的促滲作用，有望成為大分子類藥物經(jīng)皮吸收的促滲方法［3，4］。

本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)類的環(huán)孢菌素A為模型藥物，聚丙烯膜為駐極體材料，通過比較研究負(fù)極性駐極體、不同濃度氮酮以及兩者聯(lián)用的環(huán)孢菌素A溶液的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，為進(jìn)一步闡明駐極體促滲機(jī)制和研究駐極體環(huán)孢菌素A貼劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)，高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司，Agilent-1100)，柵控電暈充電系統(tǒng)(大連理工大學(xué)靜電與特種電研究所)，SD803表面電位計(jì)(機(jī)械電子部上海電動工具廠)。

1.2 藥物、試劑及材料 聚丙烯商品膜(polypropylene，PP，日本東麗株式會社)，膜厚13 μm。環(huán)孢菌素A(上海源葉生物科技有限公司，批號:CAS# 59865-13-3);氮酮(福建壽寧美菲思生物化學(xué)品廠，純度≥99.0%);甲醇、乙腈為色譜純，丙二醇、無水乙醇為分析純。

1.3 動物 雄性SD大鼠［第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SYXK(滬)2007-0003］，體重(181±28.6)g。

2 方法與結(jié)果

2.1 駐極體材料制備 PP薄膜置于常溫下電暈充電，針尖電壓－25 kV，柵壓分別為－500 V、－1 000 V、－2 000 V，注極時間5 min，制得－500 V、－1 000 V、－2 000 V駐極體。

2.2 HPLC法測環(huán)孢菌素A的含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilTM ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司);流動相為乙腈-甲醇-水=［340∶100∶60(v/v/v)］，檢測波長為214 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為60℃，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取17.90 mg環(huán)孢菌素A于100 ml容量瓶中，加入25 ml乙醇，溶解后，用pH 7.2的PBS定容至100 ml，得環(huán)孢菌素A貯備液。精密量取該貯備液0.1、0.4、0.8、3.0、8.0 ml于10 ml的容量瓶中，加pH 7.3的PBS稀釋、定容至刻度，得到濃度范圍為1.79～143.2 μg/ml的環(huán)孢菌素A標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件測定，以藥物峰面積A對環(huán)孢菌素A的濃度C(μg/ ml)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=13.799 C－1.226 9(r=0.999 97)，即在1.79～143.2 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度間有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度的測定 配制13.9、36.5、84.5 μg/ml的高、中、低3種濃度的環(huán)孢菌素A溶液作為質(zhì)控樣品，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，得日內(nèi)RSD最大值為0.676%，日間RSD最大值為2.946%，準(zhǔn)確度的RR值為100.38%～111.47%，符合方法學(xué)要求。

2.3 環(huán)孢菌素A的體外透皮特性考察

2.3.1 藥物透皮溶液的制備 精密稱取環(huán)孢菌素A，溶于丙二醇后，制得0.5%(w/w)的對照溶液。稱取一定量的丙二醇，分別按1%、3%、5%(w/w)的比例加入相應(yīng)的氮酮，混勻，再按前二者總質(zhì)量的0.5%(w/w)精密稱取環(huán)孢菌素A，待其完全溶解后，制得含化學(xué)促滲劑的藥物溶液。

2.3.2 鼠皮的處理 取大鼠，用20%烏拉坦腹腔麻醉后，用電動剃須刀小心剃去腹部鼠毛，剝離皮膚，用脫脂棉擦除皮下組織和粘連物，再用生理鹽水沖洗干凈，待用。

2.3.3 體外透皮實(shí)驗(yàn) 采用改良的Franz擴(kuò)散池，將皮膚固定于供給池和接受池之間，角質(zhì)層面向供給池。供給池中分別放入對照溶液、含化學(xué)促滲劑A。式中 V為接受池的體積(6.75 ml)，Vi為取樣體積，cn為第n個取樣點(diǎn)藥物的校正濃度，ci為第i個取樣點(diǎn)的實(shí)測濃度，A為有效擴(kuò)散面積(2.8 cm2)。

2.3.4 負(fù)極性駐極體對環(huán)孢菌素A透皮的影響

對照溶液覆蓋駐極體后，駐極體實(shí)驗(yàn)組和對照溶液的透皮行為如圖1所示。結(jié)果顯示，在0～8 h的實(shí)驗(yàn)過程各實(shí)驗(yàn)組環(huán)孢菌素A的累積滲透量為零。在8～24 h的實(shí)驗(yàn)過程中，不同表面的負(fù)極性駐極體對模型藥物均具有一定的促滲效果且滿足指數(shù)上升規(guī)律，－500 V、－1 000 V、－2 000 V駐極體作用后，環(huán)孢菌素A的24 h累積滲透量分別為7.52、9.28、8.86 μg/cm2，分別是對照溶液的1.20、1.48、1.41倍。結(jié)果表明，負(fù)極性駐極體對環(huán)孢菌素A的經(jīng)皮吸收有促滲作用。的含藥溶液、對照溶液覆蓋駐極體(與溶液液面保持約1 mm高度)，接受池中放入體積比為75∶25的pH 7.2的PBS與乙醇的混合溶液。水浴溫度為(37.0±0.5)℃，磁力攪拌速度為320 r/min，分別于8、12、16、20、24 h從接受池取樣，每次取樣1 ml，并補(bǔ)充等量的接受介液，按2.2.1項(xiàng)下的條件測定，并按下式計(jì)算環(huán)孢菌素A的體外累積滲透量(Q)∶

圖1 負(fù)極性駐極體作用下環(huán)孢菌素A的透皮量(n=4)

2.3.5 不同濃度氮酮對環(huán)孢菌素A透皮的影響圖2為含化學(xué)促滲劑的含藥溶液和對照溶液的透皮行為。結(jié)果顯示，1%氮酮、3%氮酮和5%氮酮均可有效提高環(huán)孢菌素A的透皮速率、增加環(huán)孢菌素A的透皮量和縮短環(huán)孢菌素A透皮的遲滯時間。1%、3%、5%氮酮的環(huán)孢菌素A溶液的24 h累積滲透量分別為66.35、31.71、21.40 g/cm2，是空白對照組的10.56、5.05、3.41倍(P＜0.05)。其中，1%氮酮對環(huán)孢菌素A的促滲能力最強(qiáng)。

2.3.6 負(fù)極性駐極體與氮酮聯(lián)用對環(huán)孢菌素A透皮的影響 含促滲劑的藥物溶液覆蓋駐極體后，除－1 000 V駐極體與1%氮酮聯(lián)用組環(huán)孢菌素A的 24 h累積滲透量高于1%氮酮實(shí)驗(yàn)組外(P＞0.05) (圖3)，其余各組的累積滲透量均小于對應(yīng)氮酮促滲組(圖4、圖5)。與對照組和不同濃度氮酮實(shí)驗(yàn)組相比，24 h后，－1 000 V駐極體與1%氮酮聯(lián)用組環(huán)孢菌素A的累積透皮量分別是對照組、1%氮酮、3%氮酮和5%氮酮的12.64、1.2、2.5、3.1倍。

圖2 不同濃度氮酮作用下環(huán)孢菌素A的透皮量(n=4)

圖3 不同表面電位負(fù)極性駐極體與1%氮酮對環(huán)孢菌素A體外透皮累積滲透量(n=5)

圖4 不同表面電位負(fù)極性駐極體與3%氮酮對環(huán)孢菌素A體外透皮累積滲透量(n=5)

圖5 不同表面電位負(fù)極性駐極體與5%氮酮對環(huán)孢菌素A體外透皮累積滲透量(n=5)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平(P)為0.05。

3 討論

聚丙烯駐極體是能夠長期儲存大量空間電荷的功能電介質(zhì)材料，它產(chǎn)生的靜電場不僅可穿越離體皮膚并保持相對穩(wěn)定，而且可在離體皮膚內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生生物電流［5］。當(dāng)駐極體作用離體皮膚，它產(chǎn)生的靜電場和微電流可改變皮膚的自然極化狀態(tài)，導(dǎo)致皮膚角質(zhì)層層狀類脂結(jié)構(gòu)的改變和皮膚附屬器毛囊口的拓寬，從而產(chǎn)生大量新孔道，并使這些新增孔道持續(xù)開放，這些結(jié)果可直接導(dǎo)致角質(zhì)層“磚墻結(jié)構(gòu)”的改變，藥物分子通過這些孔道經(jīng)皮傳遞而增加通透量，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)藥物滲透的目的［3］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，負(fù)極性駐極體作用下的環(huán)孢菌素A溶液或單獨(dú)的環(huán)孢菌素A溶液經(jīng)皮滲透存在時滯現(xiàn)象。這是因?yàn)橐环矫骜v極體對皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的影響有時間延遲效應(yīng)［6］;另一方面環(huán)孢菌素A是較大分子脂溶性多肽類藥物(分子量1 202.63Da)，其高分子量和脂質(zhì)溶解性使其容易在皮膚角質(zhì)層和皮膚的深層形成儲庫而不易經(jīng)皮擴(kuò)散。因此，不同表面電位的負(fù)極性駐極體對環(huán)孢菌素A的體外促滲在宏觀上表現(xiàn)出遲滯現(xiàn)象。此外，3種負(fù)極性駐極體中，－1 000 V駐極體對環(huán)孢菌素A的促滲效果最佳。駐極體作用下的皮膚顯微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，在－500 V～－2 000 V電壓范圍內(nèi)，－1 000 V駐極體對皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)具有最佳的調(diào)控作用［7］。

氮酮由弱極性氮雜環(huán)和非極性結(jié)構(gòu)長鏈烷烴或烯烴組成，是常用的化學(xué)促滲劑，對于親水性和親脂性化合物均具有良好的促透效果，尤其對親水性藥物促滲效果更佳。氮酮可以增加脂質(zhì)雙分子層的流動性，增加角質(zhì)層的含水量，而且氮酮濃度越高，角質(zhì)層的含水量越多，脂溶性藥物不易通過，促滲效果減弱［8］。環(huán)孢菌素A為脂溶性藥物，隨著氮酮濃度的增加，其促滲效果也相應(yīng)減弱。因此本實(shí)驗(yàn)中，1%氮酮對環(huán)孢菌素A的促滲作用優(yōu)于3%氮酮和5%氮酮，其24 h的累積滲透量分別為3%和5%氮酮促滲組的2.09倍和3.10倍。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果還表明，－1 000 V駐極體與1%氮酮聯(lián)用可提高環(huán)孢菌素A的透皮速率和透皮量，該作用產(chǎn)生的主要機(jī)制，一方面是駐極體作用大鼠皮膚改變了大鼠皮膚的電極化狀態(tài)和角質(zhì)層的空間結(jié)構(gòu)，新增了大量可逆性孔道，從皮膚表面經(jīng)孔道擴(kuò)散進(jìn)入角質(zhì)層及皮膚各層的1%氮酮進(jìn)一步改變了脂質(zhì)雙分子層的有序排列，且增加了脂質(zhì)的流動性。另一方面，1%氮酮還使從貼劑中進(jìn)入皮膚各層的環(huán)孢菌素A部分溶解并滯留在皮膚中，在皮膚中的大量環(huán)孢菌素A在自然擴(kuò)散力和駐極體外電場力的作用下定向運(yùn)動通過皮膚各層。而3%和5%的氮酮增加了角質(zhì)層的含水量，高濃度的水分子在駐極體的外靜電場作用下極化，使得皮膚內(nèi)的電場強(qiáng)度減弱，電場對藥物的作用力減小。因此，－1 000 V駐極體與3%和5%氮酮聯(lián)用，藥物的透皮速率和透皮量反而減小。

［1］ Wang S，Kara M，Krishnan TR.Transdermal delivery of cyclosporin-A using electroporation［J］.J Control Release，1998，50: 61.

［2］ 夏鐘福.駐極體［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:2.

［3］ Cui LL，Hou XM，Jiang J，et al.Comparative enhancing effects of electret with chemical enhancers on trnasdermal delivery of meloxicam in vitro［J］.J Phys:Conf Ser，2008，142:012015.

［4］ 孔玉秀，程 亮，肖永恒，等.駐極體利多卡因貼劑的促滲作用［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(5):469.

［5］ Jiang J，Liang YY，Dong FJ，et al.Study of electret effect of rat skin by thermally stimulated discharge analysis［J］.J Electrostat，2012，70:258.

［6］ 梁媛媛，董法杰，馬 琳，等.駐極體對大鼠皮膚顯微結(jié)構(gòu)影響的時間效應(yīng)研究［J］.廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(2): 88.

［7］ Cui LL，Liang YY，Dong FJ，et al.Structure of rat skin after application of electret characterized by DSC［J］.J Phys:Conf Ser，2011，301:012027.

［8］ Harrison JE，Watkinson AC，Green DM，et al.The relative effect of Azone and Transcutol on permeant diffusivity and solubility in human stratum corneum［J］.Pharm Res，1996，13:542.