趙 杰， 官守濤， 孫設(shè)宗， 張紅梅， 劉興林

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院生化與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，湖北 十堰442000)

中藥半枝蓮Herba Scutellariae barbatae為唇形科Labiatae植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草［1］，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫等功效，現(xiàn)代臨床多用于治療癌癥、肝炎等疾病，療效確切［2］。對于半枝蓮有效成分的研究多集中于黃酮類成分的研究，而對其中的多糖研究相對較少。近年來隨著對植物多糖研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)許多中草藥富含活性多糖成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒等多種作用［3-4］，且都與其抗氧化作用密切相關(guān)［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，半枝蓮多糖具有增強(qiáng)免疫、體外抑瘤等作用［6-7］。本實(shí)驗(yàn)利用優(yōu)化的水提醇沉工藝提取半枝蓮多糖并對其清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行研究，以期為半枝蓮多糖和半枝蓮資源的深入研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)信息。

1 材料

1.1 藥品與試劑 半枝蓮采自武當(dāng)山鎮(zhèn)近郊，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)教研室鑒定，于40℃烘干后粉碎，過40目篩，備用。試驗(yàn)用鄰苯三酚、硫酸亞鐵、過氧化氫 (H2O2)、硫代巴比妥酸 (TBA)、三氯乙酸 (TCA)、水楊酸、四氯化碳 (CCl4)等主要試劑均為分析純。丙二醛 (MDA)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿機(jī) (浙西機(jī)械廠)，RE—52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海青浦滬西儀器廠)，MDF一382E型超低溫冰箱 (日本Sony公司)，722S型分光光度計(jì)(上海第二光學(xué)儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋，回流提取裝置，抽濾器等。

1.3 動物 4月齡昆明種小鼠，體質(zhì)量 (30±2)g，雌雄各半，由本院動物中心提供 ［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(鄂)2005-0031］。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試物的制備 稱取干燥粉碎的半枝蓮若干，用適量95%乙醇浸泡靜置過夜，過濾除去上清液。沉淀物于80℃水浴中將乙醇揮干后，加入20倍體積蒸餾水，于60℃水浴中浸提2 h，連續(xù)提取3次，合并浸提液低溫靜置后離心，上清液濃縮為原體積的1/4后用Savage法脫蛋白;按比例加入無水乙醇，使乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)多糖析出，低溫靜置過夜后，4 000 r/min離心10 min，所得沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌3次，透析72 h，真空冷凍干燥，制成多糖含有量為45.7%(蒽酮法)的棕褐色粉末，即半枝蓮多糖 (SPS)。準(zhǔn)確稱取半枝蓮多糖2.188 g，溶于100 mL蒸餾水中，制成多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL的半枝蓮多糖溶液，試驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行稀釋即可。

2.2 對超氧陰離子自由基 (O-2)清除率的測定［8］采用鄰苯三酚自氧化法。加50 mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，25℃保溫20 min。各管加入不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖溶液0.1 mL及25℃保溫過的6 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL，混勻后，25℃準(zhǔn)確保溫4 min，立即用3 mol/L HCl溶液0.2 mL終止反應(yīng)，322 nm處測定吸光度A值。受試藥調(diào)零管將加入鄰苯三酚和鹽酸的次序顛倒，對照管和對照調(diào)零管用蒸餾水代替半枝蓮多糖。清除率計(jì)算公式如下:

清除率=(ΔA對-ΔA樣)/ΔA對×100%，其中 ΔA對為鄰苯三酚自氧化速率;ΔA樣為加入不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖后鄰苯三酚的自氧化速率。

結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半枝蓮多糖、維生素C對超氧陰離子的生成均有清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加作用增強(qiáng)。在較低質(zhì)量濃度時(shí)，半枝蓮多糖對超氧陰離子的清除作用強(qiáng)于維生素C。

圖1 半枝蓮多糖、維生素C對超氧陰離子的清除作用

2.3 對羥自由基 (·OH)的清除率的測定［9］參考Fenton反應(yīng)體系模型，采用固定時(shí)間反應(yīng)法，反應(yīng)體系中含8.8 mmol/L H2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖溶液1 mL。最后加H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，在510 nm下測量各濃度的吸光度。受試藥調(diào)零管則以蒸餾水代替H2O2，對照管和對照調(diào)零管則以蒸餾水代替半枝蓮多糖。清除率計(jì)算公式:清除率 =(A對-A樣)/A樣×100%，其中 A對為空白對照液的吸光度，A樣為加入半枝蓮多糖溶液后的吸光度。

結(jié)果見圖2。由圖2可見，半枝蓮多糖和維生素C在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對·OH的清除作用均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，并且半枝蓮多糖清除·OH的能力要優(yōu)于維生素C。

圖2 半枝蓮多糖、維生素C對羥自由基的清除作用

2.4 對健康小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響［10］健康昆明種小鼠禁食12 h，斷頭處死。迅速取出肝臟，用4℃生理鹽水洗凈表面殘血，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液 (PBS)在冰浴條件下制成10%肝勻漿，4 000 r/min離心5 min，取上清液用雙縮脲法測蛋白質(zhì)含量，用PBS稀釋成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4 mg/mL的溶液備用。取肝勻漿1.0 mL于試管中，加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度半枝蓮多糖溶液，對照組以蒸餾水代替半枝蓮多糖溶液，混勻，37℃水浴恒溫振蕩1.5 h后取出，加10%三氯乙酸2.0 mL，混勻，0.67%TBA 1.0 mL，混勻，沸水浴中反應(yīng)15 min，取出后流水冷卻，以3 000 r/min離心15 min，取上清液在波長532 nm處比色，以空白管調(diào)零，測定A值，以A532值表示MDA的水平，MDA的抑制率計(jì)算公式:抑制率=(A對照-A樣品)/A對照×100%。

丙二醛 (MDA)是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，其含有量的多少直接反應(yīng)肝細(xì)胞受自由基攻擊的程度。不同質(zhì)量濃度半枝蓮多糖溶液均可抑制肝勻漿的自發(fā)性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并且隨著半枝蓮多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，抑制率也逐步提高。結(jié)果見表1。

表1 對健康小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響 (± s，n=5)

表1 對健康小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響 (± s，n=5)

注:與對照組比較，*P＜0.01。

組別 終質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)A532抑制率/%0.261±0.013 -維生素C組 0.80 0.137±0.010* 47.51半枝蓮多糖組 0.50 0.202±0.008* 22.61半枝蓮多糖組 1.00 0.158±0.013* 39.46半枝蓮多糖組 1.50 0.135±0.009*對照組-48.28

2.5 對健康小鼠肝勻漿Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響［11］方法同2.4項(xiàng)，但反應(yīng)體系中加6 mmol/L硫酸亞鐵0.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL，于37℃水浴恒溫振蕩1.5 h，以A532表示MDA的生成量，并計(jì)算抑制率。結(jié)果見表2。

由表2可見，半枝蓮多糖各劑量組能顯著抑制Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的健康小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制率也顯著提高。

表2 對健康小鼠肝勻漿Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響(±s，n=5)

表2 對健康小鼠肝勻漿Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響(±s，n=5)

注:與對照組比較，*P＜0.01。

組別 終質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)A532 抑制率/%對照組-0.885±0.012 -維生素C組 0.80 0.291±0.015* 67.12半枝蓮多糖組 0.50 0.729±0.009* 17.63半枝蓮多糖組 1.00 0.638±0.011* 27.91半枝蓮多糖組 1.50 0.509±0.007*42.49

2.6 對CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA水平的影響 50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分正常組、模型組、半枝蓮多糖高、中、低劑量用藥組。各組均常規(guī)飼料，自由飲水，用藥組按體質(zhì)量50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg半枝蓮多糖灌胃，每天1次，連續(xù)給藥7 d，末次灌胃2 h后，除正常對照組只腹腔注射調(diào)和油溶液外，其余各組均腹腔注射0.15%CCl4調(diào)和油溶液 (按10 mL/kg體質(zhì)量計(jì)算劑量)，12 h后禁食不禁水，24 h后處死小鼠。迅速取出肝臟并按2.4項(xiàng)下方法制備蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4 mg/mL的肝勻漿備用，按試劑盒要求測MDA的水平。

CCl4肝損傷模型組小鼠肝臟MDA顯著升高，與對照組比較差異有顯著性 (P＜0.01)說明肝損傷模型是成功的。不同劑量的半枝蓮多糖用藥組可降低肝勻漿中MDA水平，與模型組比較差異有顯著性 (P＜0.01)。結(jié)果見表3。

表3 對CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA水平的影響(±s，n=10)

表3 對CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA水平的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別 劑量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mg-1pro)正常組 3.73±1.78*模型組 8.60±3.34半枝蓮多糖組 50 4.59±1.80*半枝蓮多糖組 100 4.33±1.40*半枝蓮多糖組 200 4.36±1.68*

2.7 對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿體外Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響 取2.6項(xiàng)所制各組肝勻漿1.0 mL置編號試管中，正常組加PBS 0.14 mL，其余各組加6 mmol/L Fe-SO40.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL。各管置37℃水浴中保溫25 min后，加入10%的三氯乙酸2.0 mL并快速混勻以結(jié)束脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成誘導(dǎo)。各管再加入0.67%的硫代巴比妥酸溶液1.0 mL，置沸水中15 min后取出，迅速冷卻后離心。取上清液在波長為532 nm處測定各管吸光度值，以A532nm反映MDA水平。計(jì)算半枝蓮多糖對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的CCl4肝損傷小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化-MDA產(chǎn)生的抑制率。

將CCl4肝損傷小鼠肝勻漿中加入誘導(dǎo)劑，通過保溫過程中可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的生成，模型組A532明顯的高于對照組，說明誘導(dǎo)肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物是成功的。不同劑量半枝蓮多糖用藥組A532與模型組比較明顯降低，證明半枝蓮多糖進(jìn)入體內(nèi)后可被充分吸收利用并對抗自由基，能明顯抑制脂質(zhì)過氧化物MDA產(chǎn)生。結(jié)果見表4。

表4 對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響( ± s，n=10)

表4 對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿Fe2+-H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的影響( ± s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別 劑量/(mg·kg-1) A532 抑制率/%正常組 0.217±0.136*模型組 0.665±0.139半枝蓮多糖組 50 0.403±0.167* 58.48半枝蓮多糖組 100 0.348±0.165* 70.76半枝蓮多糖組 200 0.372±0.143*65.40

3 討論

從中草藥中提取活性成分是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，多糖是中草藥中重要的活性成分之一。中草藥多糖具有增強(qiáng)免疫、抗衰老、抗氧化等方面的作用［3］，臨床上無論是免疫性損傷還是炎性損傷都與氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)密切相關(guān)。使用生物抗氧化劑切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以抑制機(jī)體的自由基損傷，從而保持機(jī)體最佳健康狀態(tài)和防治相關(guān)疾病，延緩衰老［12］。

氧自由基可促發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，氧化損傷可引起MDA生成量增加。MDA在血清或組織中的水平，則能反應(yīng)自由基對組織的破壞程度。健康小鼠的肝勻漿在37℃孵育后可自發(fā)性的發(fā)生脂質(zhì)過氧化，加入Fe2+-H2O2誘導(dǎo)劑可使脂質(zhì)過氧化加劇，MDA生成量顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在其中加入不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖可顯著降低健康小鼠肝勻漿自氧化與Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量，說明半枝蓮多糖具有體外抗脂質(zhì)過氧化作用。然而，體外的實(shí)驗(yàn)環(huán)境與機(jī)體的內(nèi)環(huán)境畢竟不同，半枝蓮多糖進(jìn)入機(jī)體經(jīng)過胃腸道的消化吸收后是否仍具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化作用呢?實(shí)驗(yàn)以不同劑量的半枝蓮多糖給小鼠預(yù)防性灌胃7 d后注射CCl4，通過測定肝勻漿中MDA水平及再次進(jìn)行體外誘導(dǎo)試驗(yàn)的方法探討半枝蓮多糖進(jìn)入體內(nèi)后的抗脂質(zhì)過氧化作用。CCl4所致的化學(xué)性肝損傷主要是通過脂質(zhì)過氧化作用引起的，在過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生過量的和·OH等，可無選擇性的損傷肝細(xì)胞的各個(gè)組分［13］。結(jié)果顯示，半枝蓮多糖不同劑量給藥組能明顯減少CCl4肝損傷小鼠肝臟內(nèi)MDA的水平，對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿體外誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化同樣有顯著的抑制作用。由此說明，半枝蓮多糖進(jìn)入機(jī)體后可通過抗脂質(zhì)過氧化作用來保護(hù)機(jī)體。

綜上所述，半枝蓮多糖不僅具有體外清除氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，而且進(jìn)入小鼠體內(nèi)能被充分吸收利用，從而切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)機(jī)體免受氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化損傷，是一種有效的抗氧化物質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。

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