王恒，沈祥春，余躍生，楊紅宇，吉楊丹（.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州都勻558003；.貴陽醫(yī)學院，貴陽 550004）

20世紀初期，全球心血管病死亡率僅占總死亡率的10%以下，占發(fā)達國家總死亡率的近50%、發(fā)展中國家的25%。目前我國每年約有300萬人死于心血管病，預計到2020年，因心血管疾病致殘的人數(shù)將到達2 500萬[1]。隨著人們的生活方式和飲食結構的變化，心血管疾病患者呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，這一現(xiàn)狀已引起世界各國的高度重視，因此研制有效預防與治療心血管疾病的創(chuàng)新藥物成為當務之急。心血管系統(tǒng)疾患尤以心肌缺血及心肌梗死成為近年來創(chuàng)新藥物研究的熱點。而創(chuàng)新藥物研究的關鍵是建立基于臨床特點的、有效反映藥物療效的生物模型。筆者通過查閱2001－2011年中國知網(wǎng)、萬方、維普及PubMed、HighWire Press、EBSCO-ASP等數(shù)據(jù)庫的相關文獻，對實驗動物的選擇和方法進行歸納總結，旨在為心肌缺血/心肌梗死創(chuàng)新藥物評價提供合理可靠的生物模型。

1 整體實驗動物模型

根據(jù)多年來對心肌缺血/心肌梗死實驗動物模型的研究，目前傳統(tǒng)復制心肌缺血/心肌梗死動物模型所選用的動物大多為哺乳動物，有狗、兔、小牛、豚鼠、大鼠等。由于豬冠狀循環(huán)系統(tǒng)結構酷似人類，故近年來提倡用家豬或小豬復制心肌缺血/心肌梗死的模型[2，3]。

1.1 冠狀動脈結扎法

冠狀動脈結扎法是制作心肌缺血模型最早、且至今還普遍使用的方法[4]。其原理為：結扎冠狀動脈后血流動力學和心肌代謝的改變與冠心病患者嚴重心肌缺血及心肌梗死時有相似之處，且梗死發(fā)生快、缺血的范圍大致固定，可以進行血流動力學監(jiān)測、心電圖J點標測、組織染色檢查和血清酶學等綜合指標測定。鑒于結扎冠狀動脈主干死亡率高，所以目前結扎部位主要選用左旋冠狀動脈、冠狀動脈前降支；亦有多處結扎的方法，即同時結扎幾處的冠狀動脈分支，以形成一個梗死區(qū)域。經(jīng)驗證明，結扎的冠狀動脈因其分布的心肌范圍和該區(qū)內(nèi)是否有其他冠狀動脈決定著心肌梗死的面積。結扎狗、兔、貓、大鼠等動物的左冠狀動脈前降支均可成功造模，因此結扎冠狀動脈引起的急性或亞急性梗死疾病模型可用于藥物效應研究。結扎狗、家兔、大鼠建模舉例如下。

（1）結扎狗冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻[5]選用成年健康雜種犬，♀♂不限，體重8.5～13.1 kg。用3%戊巴比妥鈉（30mg·kg－1）麻醉實驗犬，行氣管插管，呼噯機輔助呼吸，開胸后于犬左冠狀動脈前降支的第2對角支分支處以帶線縫針進行縫扎。但狗的冠狀血管結構與人相比有較大差異，尤其是犬冠狀動脈變異多、側支吻合豐富、室間隔動脈特別發(fā)達等，故不利于梗死功能評價。

（2）結扎家兔冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻[6]選用體重2 kg以上的健康家兔，全身麻醉，仰位固定，除毛；沿胸骨中線切開皮膚、暴露胸骨，沿胸骨左緣剪斷1～3根肋軟骨；用小開胸器輕輕撐開胸腔切口，可見心包及搏動心臟；提起心包膜正中，用眼科剪將心包膜前部剪開，用止血鉗將左心耳輕輕提起，用持針器持小彎針在冠狀動脈前降支根部（較深部）穿一線結扎。為減少側支循環(huán)、增大心肌梗死面積，便于觀察藥物療效，可在結扎線下約0.5 cm處再穿一線結扎。也可結扎左室支造成心肌梗死，但結扎位置不宜過高。如果進行急性實驗，即可進行給藥觀察；如果進行亞急性實驗，結扎后即關閉胸腔，但每天應注射青霉素或鏈霉素以防止感染[7]。

兔破壞胸膜結扎冠狀動脈，方法簡便：結扎前降支根部，并進行雙重結扎阻斷，可減少側支循環(huán)的形成。此法產(chǎn)生的心肌梗死在3 d內(nèi)較穩(wěn)定，3 d后有自發(fā)緩解的趨勢，實驗時要注意。

（3）結扎大鼠冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻[7]選用250～300 g的SD♂大鼠。淺麻醉后，背位固定；用大半個橡皮球（大小正好套住大鼠頭頸部）連接到人工呼吸機，胸部去毛、消毒、沿左筋骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第4或第5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸部擠出心臟；在動脈圓錐與左心耳之間冠狀脈處結扎左冠狀動脈后，把心臟放回胸腔；迅速縫合胸壁，停止人工呼吸。如果進行急性實驗，即可進行給藥觀察；如果進行亞急性實驗，每天應注射青霉素或鏈霉素以防止感染。

1.2 藥物誘導法

（1）藥物增加心肌氧消耗。心肌缺氧是由心肌氧的供需平衡失調(diào)造成的，心肌需氧增加，供不應求，也是出現(xiàn)心肌缺血甚至壞死的重要原因。擬交感神經(jīng)藥物可使心肌氧消耗增加，大劑量用藥會引起動物心肌壞死。引起心肌缺血性損傷常用的藥物有異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素。從大動物狗到小動物貓、兔、豚鼠、大鼠及小鼠均可用，以應用大鼠為最多。最常使用的藥物為異丙腎上腺素，采用大鼠皮下注射50mg·kg－1或?qū)⑺幬锛尤?00m L氯化鈉注射液中從家兔耳靜脈勻速（4 h）滴入，可分別給藥10、20、30mg·kg－1，或直接將藥物注入腹腔，均可復制模型[8]。

（2）藥物引起冠狀血管痙攣。常用藥物是垂體后葉素，其使冠狀動脈收縮，同時也使外周血管收縮、阻力增加、血壓升高，增加后負荷而產(chǎn)生心肌缺血。其可直接作用于不同動物的離體冠狀動脈條使之收縮，如使離體兔、貓心的冠狀動脈收縮。整體動物（免、豚鼠和大鼠等）靜脈注射時，出現(xiàn)典型的缺血性心電圖改變，如麻醉狗后靜脈注射垂體后葉素，血壓急劇升高而血流量明顯降低。引起小動物心電圖改變的垂體后葉素劑量一般為0.5～1.5 u·kg－1，5～15 s內(nèi)靜脈注入。狗的用量較小，靜脈注射0.3 u·kg－1即引起明顯的冠狀動脈痙攣[9]。由于該方法簡單、重復性好、不需特殊設備，因而廣泛用于抗心絞痛藥物篩選。

1.3 冠狀動脈氣囊法

通過放置在冠狀血管內(nèi)或血管外的可膨脹氣囊（或水囊）阻塞或壓迫血管而引起的冠狀動脈閉塞[10]。

（1）冠狀動脈內(nèi)氣囊法。冠狀動脈內(nèi)氣囊法是采用特制的雙腔氣囊導管，在X射線監(jiān)視下經(jīng)狗的頸總動脈插入到左冠狀動脈前降支或旋支的合適部位，注入50%的液體使氣囊膨脹，每天應注射青霉素和鏈霉素以防止感染并控制所在部位氣囊膨脹的程度。在雙腔氣囊導管的另一端則分別連接注射器，從外導管注入氣體以膨脹氣囊和經(jīng)內(nèi)導管向缺血區(qū)注射藥物或抽取血樣品，并可測定返回血流和返回壓力。如在內(nèi)導管內(nèi)裝入鉑金電極還可測定缺血區(qū)冠狀動脈內(nèi)心電圖。該法不需開胸，避免了因開胸對血流動力和心肌代謝的影響；可完全或部分閉塞，也可突然或逐漸以及反復閉塞。

（2）冠狀動脈外氣囊法。冠狀動脈外氣囊法是在將動物麻醉開胸后，分離出左冠狀動脈1 cm左右（大多數(shù)是前降支）并放入壓迫器內(nèi)。當氣囊膨脹時，壓迫血管而阻斷血流，短期阻斷產(chǎn)生心肌缺血，長期阻斷則產(chǎn)生心肌梗死。同一只動物，可在清醒狀態(tài)下反復阻斷冠狀動脈以引起心肌缺血。如在壓迫器的近心端冠狀動脈上放置1個電磁流量計換能器，則可監(jiān)測閉胸情況下部分閉塞冠狀動脈的程度。因此，該法是藥理研究中常用的方法之一。

1.4 電刺激法

犬急性心肌梗死模型的建立：肌肉注射氯胺酮100～200 mg麻醉犬、注射用維庫溴銨0.1mg松弛犬氣管平滑肌，氣管插管后連接呼吸機并予心電監(jiān)護；沿胸骨左緣第3～4肋骨開胸，逐層打開至心包膜，制作心包吊床，清晰暴露左冠狀動脈前降支血管；距離前降支開口約1.5 cm處將正、負刺激電極間隔1 min置前降支血管外膜，微電流刺激儀刺激犬冠狀動脈血管外膜，電流由小至大逐漸加強，刺激血管外膜15～20 cm，間隔10min。心電監(jiān)護顯示心電穩(wěn)定后，同部位再次予電流刺激20min至血管外膜顏色加深為止。觀察無嚴重心律失常及出血等，逐層縫合關閉胸腔，置胸腔引流水封瓶[11]。

2 離體心臟模型

近年來，在心肌缺血的研究中，離體心臟灌流技術越來越多被采用。正常離體心肌在缺氧時再給氧可加劇心肌組織缺血性損傷，與臨床冠狀動脈搭橋術、溶栓術及冠狀動脈痙攣等灌注所致心肌損傷相似。

一般用朗根多夫（Langendorff）法對離體豬、兔和大鼠心臟進行灌流，以通Krebs-henseleit液灌流或結扎心臟的冠狀動脈，引起全心或局部心肌缺氧，觀察整個心臟或局部心肌的冠狀動脈血流、心收縮力、心外膜電圖以及冠狀動脈流出液中乳酸、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性和鉀離子、環(huán)磷酸腺苷含量以了解心肌缺血程度和心肌缺血時的功能和代謝；并可直接測定心肌內(nèi)上述指標的改變來評價藥物對冠狀動脈血管、心臟功能和心肌代謝的直接作用[12]。

在整體條件下心臟的能量來源主要為血液中的脂肪酸，而離體心肌缺氧/再給氧損傷模型能量來源則為灌流液中的葡萄糖，且離體心臟失去整體條件下的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，故不可視為此模型完全等同于在體心臟。離體心臟維持不久，故須在一定時間內(nèi)完成，此亦受到限制。

3 體外培養(yǎng)心肌細胞

3.1 過氧化氫（H2O2）誘導法建立心肌損傷模型

取生長良好的細胞隨機分組，同時加入藥物4 h后再加H2O2（終濃度為0.5mmol·L－1）刺激細胞4 h，即可造模成功[13]。

3.2 氰化鈉復制心肌細胞損傷模型

當氰離子與氧化型細胞色素氧化酶中的三價鐵結合后，由于二者的結合力較強，阻止氧化酶中三價鐵的還原，即阻斷了氧化過程中的電子傳遞，組織細胞不能利用組織液中的氧（等同于乏氧性缺氧或缺血性缺氧時的組織液中缺氧），細胞處于內(nèi)窒息狀態(tài)。因此，氰化鈉引起的細胞缺氧模型相當于各種缺氧的終末階段，即細胞對氧的利用障礙[14]。如，取生長良好的細胞隨機分組，給予1μmol·m L－1的氰化鈉作用24 h可復制心肌細胞損傷[15]。

3.3 兒茶酚胺誘導心肌損傷模型

兒茶酚胺（Catecholamines，Cas）作為誘導心肌肥大的神經(jīng)體液刺激因素之一，具有通過腎上腺素受體（Adrenergic receptor，AR）直接促進心肌肥大效應及肌球蛋白基因表達的作用。異丙腎上腺素（ISO）和腎上腺素（NE）是經(jīng)典的體外誘導心肌細胞肥厚致心肌損傷的因素[16]。如，常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞2 d后，換液，為了減少血清中的成分對實驗結果的影響，換液時更換含小牛血清體積分數(shù)為0.000 4的培養(yǎng)基，并采用20μmol·L－1的ISO復制心肌損傷模型[17]。

心肌細胞培養(yǎng)能夠排除神經(jīng)體液、冠狀動脈血管差異等因素影響，所有的細胞處于均一的環(huán)境中，故實驗可靠。但是這個方法是缺氧而不是缺血情況，且缺氧細胞生成的代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中積累升高，故與整體動物心肌組織缺血時的環(huán)境及代謝有所差異。

4 結語

在體心肌梗死模型中結扎冠狀動脈是各種模型中最接近冠心病患者嚴重缺血及梗死的病理狀態(tài)，其他各種模型亦各有優(yōu)缺點。所以，在創(chuàng)新藥物研究過程中，應根據(jù)不同階段的需要，選擇合適的模型，以提高研究效率、降低研究風險。

[1]馬愛群，胡大一.心血管病學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：356-357.

[2]李欣志，馬曉斌，李 磊，等.小型豬冠心病模型痰瘀互結證侯診斷與評分[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2009，15（11）：825.

[3]林 斌，孔繁智.生脈散對小型豬急性心肌缺血的保護作用[J].浙江中醫(yī)雜志，2004，39（6）：266.

[4]徐叔云，卞如漆，陳 修.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1 052-1 053.

[5]鄧輝勝，郭 睿，黃 晶，等.經(jīng)動脈超聲導管印壓檢測犬梗死心肌硬度[J].中國醫(yī)學影像技術，2011，27（4）：657.

[6]王春田.細胞移植用兔心肌梗死動物模型的探討[J].中外健康文摘，2011，8（12）：28.

[7]陳祖云，肖婷婷，王 恒，等.氧化苦參堿對大鼠冠狀動脈結扎誘發(fā)實驗性急性心肌梗死的保護作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（6）：1 303.

[8]周玖瑤，孫毅東，鄧素堅，等.環(huán)維黃楊星D對心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（4）：285.

[9]周玖瑤.環(huán)維黃楊星D抗心肌缺血機理研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2008：36.

[10]VogelHG，VogelWH.藥理學實驗指南：新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學評價[M].北京：科學出版社，2001：1.

[11]褚 俊，徐美清，何 華，等.犬急性心肌梗死模型制備的方法學研究[J].安徽醫(yī)學，2002，23（2）：6.

[12]Yang XM，Proctor JB，Cui L，etal.Mulitple，brief coronary occlusions during early eary reperfusion protect rabbit heatsby targeting cellsignaling pathways[J].Am CoilCardiol，2004，44（5）：1 103.

[13]余衛(wèi)平，錢之玉，緒廣林，等.西紅花酸對心肌細胞氧化應激損傷作用[J].中國藥科大學學報，2003，34（5）：452.

[14]Irie H，Gao JY，Gaudette GR，etal.Bothmetabolic inhibition andmitochondrial K（ATP）channelopening aremyoprotective and initiate a compensatory sarcolemmal outward membrane current[J].Circulation，2003，108（suppl1）：Ⅱ341.

[15]饒淑云，錢之玉.西紅花酸對缺糖缺氧心肌細胞損傷的保護作用[J].中草藥，2004，35（4）：427.

[16]Wang G，Wang H，Yang Y，et al.Kappa-opioid receptor stimulation inhibits grow th of neonatal rat ventrictdarmyocytes[J].Eur JPharmacol，2004，498（1-3）：53.

[17]韓瀟媛，錢之玉，張 榮，等.比較西紅花酸和西紅花苷對異丙腎上腺素損傷心肌的作用[J].藥學與臨床研究，2009，17（3）：177.