張瑩，毛春芹，陸兔林，2*，黃瑋，蘇桃，2，蔡寶昌，2

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210046)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，按醋蒸五味子生產(chǎn)工藝制備而得醋五味子飲片。主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林、河北等地。具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之功效，主要用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠等癥的治療［1］。現(xiàn)代研究表明，五味子主要化學成分為木脂素、揮發(fā)油及有機酸等三類有效成分［2-3］。具有保護肝臟［4］、抗氧化［5-6］、抗腫瘤［7］、抗衰老［8-9］、增強免疫功能［10］等多方面活性。

《中國藥典》2005年版一部44頁五味子含量測定項下對五味子采用了五味子醇甲作為其質(zhì)量控制的指標。根據(jù)文獻研究及遼寧省主產(chǎn)地反饋的信息［11-12］，未成熟五味子果實中五味子醇甲含有量高于成熟的果實，而臨床上使用的是五味子成熟的果實。為了更好地科學地控制五味子的質(zhì)量，故將五味子醇甲及五味子乙素共同作為指標性成分，對醋五味子飲片進行質(zhì)量評價研究，為規(guī)范飲片質(zhì)量、保證臨床療效提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1100 LC高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);色譜柱為Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(大連依利特科技公司);AL104型電子天平(瑞士Mettler公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TGL—16臺式高速離心機(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥五味子醇甲對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110857-200605);五味子乙素對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110765-200508)。甲醇(色譜純，Tediacompany)，水(超純水)，其余試劑均為分析純。

1.3 飲片生五味子飲片，購自五味子主產(chǎn)地遼寧、黑龍江等地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院巢建國教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，按醋蒸五味子生產(chǎn)工藝制備而得的醋五味子飲片。見表1。

表1 樣品來源及批次Tab.1 Sam p le sources and batches

2 薄層色譜鑒別

取醋五味子粉末1 g，加二氯甲烷20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取醋五味子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取五味子甲素對照品，加二氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以展開系統(tǒng)1［石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)］的上層溶液及展開系統(tǒng)2［正己烷-乙酸乙酯(8∶3)］為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。比較薄層色譜的分離情況，最終確定將石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)展開系統(tǒng)列入標準正文。見圖1。

圖1 醋五味子薄層色譜圖Fig.1 TLC identification of Schisandra chinensis processed w ith vinegar

3 雜質(zhì)、水分、灰分及浸出物檢查

照《中國藥典》2005年版一部雜質(zhì)檢查法(附錄IXA)、水分測定法(附錄ⅨH第二法)、灰分測定法(附錄ⅨK法)、醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法(附錄ⅩA)對10批次的醋五味子樣品進行測定，計算結(jié)果見表2、表3。

表2 不同批次醋五味子中雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物Tab.2 Im purities，moisture，ash and extract contents of Schisandra chinensis processed w ith vinegar in different batches

表3 生五味子中雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物Tab.3 Im purities，moisture，ash and extract contents of Schisandra chinensis

4 樣品測定

4.1 色譜條件Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，0～10 min(A為68%)，10～13 min(A為68%～77%)，13～30 min，(A為77%);柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;測定波長250 nm;進樣量10 μL。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計算應不低于2 000。

4.2 對照品溶液的制備精密稱取五味子醇甲及五味子乙素對照品適量置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含0.78 mg/mL五味子醇甲及0.956 mg/mL五味子乙素的混合對照品溶液。

4.3 供試品溶液的制備取醋五味子粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(500 W)提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。

4.4 專屬性試驗分別取對照品、醋五味子樣品、空白溶劑注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件，進樣10 μL，測定，結(jié)果見圖2。

圖2 對照品(A)、供試品(B)與空白溶液(C)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and blank solution(C)

4.5 線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使五味子醇甲質(zhì)量濃度分別為0.015 6、0.031 2、0.046 8、0.062 4、0.078、0.093 6、0.109 2 mg/mL;五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為0.007 648、0.015 296、0.022 944、0.030 592、0.038 24、0.045 888、0.053 536 mg/mL。各對照品液分別進樣10 μL，重復2次，按上述色譜條件進行測定，以峰面積均值(Y)為縱坐標，進樣濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。五味子醇甲回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍分別為:Y=20 247X+3.836，r=1.000 0;0.156～1.092 μg線性關(guān)系良好。五味子乙素回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍分別為:Y=16 538X－0.814，r=0.999 9;0.076 48～0.535 36 μg線性關(guān)系良好。

4.6 精密度試驗取供試品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各自峰面積，RSD值分別為0.18%、0.36%。結(jié)果表明儀器精密性良好。

4.7 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，每隔2 h進樣1次，記錄五味子醇甲、五味子乙素18 h內(nèi)的峰面積，RSD分別為0.20%，0.43%。結(jié)果表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

4.8 重復性試驗取同一批號樣品，平行稱取6份，按4.3項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定五味子醇甲、五味子乙素，RSD分別為0.46%、0.37%，結(jié)果表明該方法具有較好的重復性。

4.9 加樣回收率試驗精密稱取五味子醇甲質(zhì)量分數(shù)為0.78%，五味子乙素質(zhì)量分數(shù)為0.57%的五味子粉末0.1 g，平行9份，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入0.8、1.0、1.2 mL五味子醇甲對照品液(0.780 mg/mL)，及0.5、0.6、0.7 mL五味子乙素對照品液(0.956 mg/mL)各3份。按4.3項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定五味子醇甲、五味子乙素，計算準確度，見表4。結(jié)果表明，準確度良好，符合定量測定的要求。

4.10 樣品測定取不同批次醋五味子粉末0.2 g，精密稱定，每批樣品平行稱取2份，按照供試品溶液制備的方法制備，每一份樣品進樣2次進行測定。對10個批次的醋五味子樣品進行測定，測定結(jié)果見表5、表6。

5 討論

5.1 根據(jù)不同產(chǎn)地醋五味子飲片實驗測定結(jié)果，按平均值的±20%作為限度制定幅度。暫定醋五味子飲片雜質(zhì)不得過0.7%，水分不得過13.0%，灰分不得過6.0%，浸出物量不得低于28.0%，含五味子醇甲和五味子乙素的質(zhì)量分數(shù)不得少于0.80%。

表4 加樣回收試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests

表5 醋五味子的測定結(jié)果Tab.5 Content determ ination results of Schisandra chinensis processed w ith vinegar

表6 五味子的測定結(jié)果Tab.6 Content determ ination results of Schisandra chinensis

5.2 分別采用不同體系、不同比例的流動相及不同色譜柱進行色譜分離，最終確定色譜條件為:Hypersil ODS柱色譜(250×4.6 mm，5μm);流動相為0～10 min，甲醇-水(68∶32)，10～13 min，甲醇(68→77)，13～30 min，甲醇-水(77∶23)。分離效果最佳。

5.3 醋五味子主要含有脂溶性成分，極性較小，故對其醇溶性浸出物進行研究，考慮到指標性成分的極性，最終選用95%的乙醇作為提取溶劑。此外，考慮到醇冷浸法時溫度差異對結(jié)果影響較大，因此選用熱浸法。

5.4 根據(jù)文獻研究及遼寧省主產(chǎn)地反饋的信息，未成熟五味子果實中五味子醇甲含有量高于成熟的果實，而臨床上使用的是五味子成熟果實，故在2005年版《中國藥典》五味子含量測定項下對五味子醇甲作為其質(zhì)量控制指標的基礎(chǔ)上增加了五味子乙素共同作為定量控制的指標性成分，更好地科學地控制醋五味子的質(zhì)量。

5.5 采用HPLC法測定不同產(chǎn)地醋五味子飲片中五味子醇甲、五味子乙素，結(jié)果顯示，該法操作簡便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強，可用于醋五味子中有效成分定量測定和質(zhì)量控制。

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