暴鳳偉，劉玉強(qiáng)，胡麗萍，張振秋，侯學(xué)智，謝劍琳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國常用的傳統(tǒng)中藥。味苦，性微寒;歸心、肝經(jīng);具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，涼血消癰等功效;用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛［1］。丹參有效成分分為脂溶性成分和水溶性成分兩大類［2］，脂溶性成分主要有丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮Ⅰ等;水溶性成分主要有丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等。有關(guān)丹參酚酸提取物的報(bào)道［3-6］多為藥理作用和定量測(cè)定方法的研究，但同時(shí)測(cè)定丹參酚酸提取物中5種物質(zhì)的報(bào)道較為少見。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)［7-8］建立了同時(shí)測(cè)定丹參酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種成分的分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為更好地控制丹參酚酸提取物的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent-1100型高效液相色譜儀(儀器編號(hào):20041191 DE43607375)，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、VWD檢測(cè)器;AS3120A超聲提取器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)、METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士);U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)(日立公司)。

1.2 試藥對(duì)照品丹參素鈉(批號(hào):110855-200809，純度為100%)，原兒茶醛(批號(hào):110810-200205，純度為98.6%)，迷迭香酸(批號(hào):111871-201001，純度為98.8%)和丹酚酸B(批號(hào):111562-201009，純度為96.0%)均購于中國食品藥品檢定研究院。紫草酸(批號(hào):110326，純度為98.8%)購于四川省維克奇生物科技有限公司。本研究收集了來自于上海、浙江、河北、云南、北京、山東、遼寧7個(gè)不同來源的丹參藥材，編號(hào)依次為1～7號(hào)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定均為正品藥材。乙腈、甲醇為色譜純(山東禹王化學(xué)試劑公司)，水為重蒸餾水，磷酸為分析純。

1.3 丹參酚酸提取物的制備取丹參藥材，加水回流提取3次，每次2 h，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加10倍量，濾過，合并濾液，并濃縮，通過AB-8大孔吸附樹脂柱，依次用水和50%的乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Phenomsil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(見表1);檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm(0～50 min，丹參素鈉、原兒茶醛)，330 nm(50～68 min，迷迭香酸)，286 nm(68～90 min，紫草酸、丹酚酸B);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Procedures of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5個(gè)對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉0.566 0 mg、原兒茶醛0.830 mg、迷迭香酸0.525 0 mg、紫草酸0.614 0 mg、丹酚酸B1.300 mg的對(duì)照品貯備液，備用。分別精密量取上述5個(gè)對(duì)照品貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉16.98 μg、原兒茶醛8.300 μg、迷迭香酸46.20 μg、紫草酸42.37 μg、丹酚酸B 650.0 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取不同來源的丹參酚酸提取物約50 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率25W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)按上述色譜條件，分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明混合對(duì)照品溶液色譜圖上，對(duì)照品色譜峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，拖尾因子均在0.95～1.05之間;在供試品溶液的色譜圖上，與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜峰與其臨峰的分離度均大于1.5?；旌蠈?duì)照品溶液及供試品溶液色譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察分別精密量取上述混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(5號(hào))色譜圖(B)Fig.1 Chromatograms of a m ixture of reference substances(A)，sample(NO.5)(B)

表2 5種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.2 Regression equations、correlation coefficients and linear ranges of five constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn)取丹參酚酸提取物(1號(hào))約50 mg，精密稱定。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD(n=6)分別為1.7%、1.2%、1.3%、1.5%、1.4%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)取丹參酚酸提取物(1號(hào))約50 mg共6份，精密稱定。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=6)分別為5.647、3.458、14.69、19.13、249.2 mg/g;RSD分別為1.5%、1.3%、1.5%、2.2%、1.2%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(1號(hào))，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD(n=6)分別為1.7%、1.4%、1.6%、1.5%、1.4%。結(jié)果表明，供試品溶液中上述5種物質(zhì)在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含有量(丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含有量分別為5.539、3.421、14.39、19.07、249.1 mg/g)的丹參酚酸提取物(上海)6份，每份約25 mg，精密稱定。分別準(zhǔn)確加入丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的對(duì)照品貯備液0.24、0.1、0.68、0.77、3.8 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果上述丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種物質(zhì)的平均回收率(n=6)分別為99.1%、99.2%、100.1%、99.7%、100.2%;RSD分別為2.2%、2.3%、1.9%、1.7%、2.0%。結(jié)果見表3。

2.5 樣品測(cè)定取所收集的7個(gè)不同來源丹參藥材的丹參酚酸提取物約50 mg，精密稱定。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種物質(zhì)，結(jié)果見表4。并對(duì)丹參酚酸提取物進(jìn)行綜合評(píng)分，設(shè)計(jì)丹參酚酸提取物中每種物質(zhì)的含有量評(píng)分公式均為Y=(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)×10(X為某物質(zhì)的含有量，Y為計(jì)算分值)，5種物質(zhì)權(quán)重系數(shù)均定為0.2，最終綜合評(píng)分結(jié)果公式為W=∑Y×0.2(W為綜合評(píng)分值)分，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)7個(gè)不同來源的丹參藥材的丹參酚酸提取物中5種成分進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明7個(gè)來源的丹參酚酸提取物中丹參素鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.778～8.874 mg/g，原兒茶醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.596～4.482 mg/g，迷迭香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.40～41.69 mg/g，紫草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.59～23.24 mg/g，丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)193.3～382.5 mg/g。

3.2 中藥的藥效是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，以單一物質(zhì)的含有量來評(píng)價(jià)其質(zhì)量的優(yōu)劣不能夠反映藥物發(fā)揮作用的整體性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定丹參酚酸提取物中5種成分，采用綜合評(píng)分法科學(xué)地評(píng)價(jià)丹參酚酸提取物的質(zhì)量。最終評(píng)分結(jié)果表明來自于遼寧的丹參酚酸提取物質(zhì)量最佳。

表3 丹參酚酸提取物中5種物質(zhì)加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Recovery test results of five constituents in Salvia m iltiorrhiza phenolic acids extract

表4 丹參酚酸提取物中5種成分的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Analytical results of five constituents in Salvia m iltiorrhiza phenolic acids extract(n=3)

表5 不同產(chǎn)地丹參酚酸提取物綜合評(píng)分結(jié)果表Tab.5 Assessment results of different origins Salvia m iltiorrorrhiza phenolic acids extract

3.3 目前有關(guān)丹參的文獻(xiàn)報(bào)道［9-13］，沒有同時(shí)測(cè)定丹參酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B這5種成分。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定丹參酚酸提取物中5種成分，并取得了比較滿意的結(jié)果，該分析對(duì)丹參酚酸提取物的進(jìn)一步研究、開發(fā)、利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了理論依據(jù)和科學(xué)參考。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70.

［2］肖培根.新編中藥志［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:184-200

［3］王卓，朱寶長(zhǎng)，徐楠楠，等.丹參提取物對(duì)高血脂癥地鼠糖脂代謝的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(12):2861-2863.

［4］尉萍萍，趙粼.HPLC測(cè)定丹參提取物中丹酚酸A含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(3):241-243.

［5］王潔，張均田.總丹酚酸抗腦缺血與抗血栓的關(guān)系［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1999，15(3):237-239.

［6］楊英.丹參提取物對(duì)麻醉大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響［J］.中華醫(yī)護(hù)雜志，2007，4(4):292-293.

［7］趙鳴舒，趙希賢.雙波長(zhǎng)高效液相色譜法測(cè)定丹參中多種成分的含量［J］.中國藥事，2010，24(8):804-806.

［8］王暉，張振秋.HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定迷迭香中咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(5):116-118.

［9］潘英妮，袁丹，付文衛(wèi)，等.HPLC法測(cè)定丹參類注射液中4種水溶性成分含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21(3):196-200.

［10］韋英杰，李萍，李松林.高效液相二極管陣列檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參制劑中7個(gè)成分的含量［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2006，34(12)1702-1706.

［11］潘雪梅，韋輝，劉毅，等.不同產(chǎn)丹參藥材質(zhì)量研究［J］.中草藥，2011，42(9):1833-1836.

［12］王偉，李焱，謝曉梅，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參中四種酚酸類成分的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(11):1276-1277.

［13］張雪，褚文靜，劉偉娜，等.高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定丹參滴注液中四種水溶性成分的含量［J］.分析化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(1):109-111.