錢(qián)根林 樊彥紅 潘冬春

（1.吳江市畜牧獸醫(yī)站，吳江 215200；2.吳江市松陵動(dòng)物防疫站，吳江 215200）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱(chēng)豬高致病性藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）感染所致。該病在中國(guó)的流行和分布十分廣泛，危害日趨嚴(yán)重，成為威脅豬場(chǎng)的以繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病，目前該病已存在于世界上所有養(yǎng)豬的國(guó)家及地區(qū)，且一般與圓環(huán)病毒等混合感染，已成為對(duì)養(yǎng)豬業(yè)具有重大危害的動(dòng)物疫病，由于目前尚無(wú)有效藥物可對(duì)PRRS病豬進(jìn)行治療，在臨床上主要是依靠注射PRRSV的疫苗對(duì)易感動(dòng)物進(jìn)行免疫，然后定期對(duì)抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果制訂相應(yīng)的免疫措施的方法對(duì)本病進(jìn)行預(yù)防。本文簡(jiǎn)要介紹了PPRS檢測(cè)方法的研究概況。

1 PRRSV病原的檢測(cè)

針對(duì)PRRSV的病原進(jìn)行的檢測(cè)，主要是靠分離PRRSV，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和病毒鑒定。目前報(bào)道的用于培養(yǎng)PRRSV的細(xì)胞有豬肺巨噬細(xì)胞（PAM）、MA104 細(xì)胞系的克隆株Marc-145 及HS2H 細(xì)胞、CL2421 細(xì)胞[1-2]。PAM對(duì)PRRSV有較高的敏感性，大多數(shù)毒株均適應(yīng)該細(xì)胞，特別是歐洲毒株，且產(chǎn)毒量高。但由于PAM存在豬肺原性病原體的污染，制備的技術(shù)難度大，難以獲得均質(zhì)的PAM等問(wèn)題，應(yīng)用受到限制。Marc-145 細(xì)胞在接種后4～7 d出現(xiàn)細(xì)胞呈灶狀變圓，膨大之后皺縮脫落成灶狀空洞，病料以血清和肺組織樣本分離率為最高，血清樣本最為方便。用HS2H細(xì)胞作為PRRSV分離用細(xì)胞，具有較高的敏感性，細(xì)胞病變典型，并且由于它是傳代細(xì)胞系，制備簡(jiǎn)單，容易獲得，適宜于一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、分離PRRSV。

2 PRRSV的血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和血清中和試驗(yàn)（SN）等。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)因操作簡(jiǎn)便，且敏感性和特異性較高，已成為豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要檢測(cè)方法之一。

IPMA是PRRS抗體檢測(cè)的重要方法之一。此法敏感性和特異性都比較好?？捎糜赑RRSV的抗原檢測(cè)、病毒鑒定及血清抗體檢測(cè)。Wensvoor等建立的IPAM檢測(cè)PRRS抗體至今仍是歐洲常用的檢測(cè)手段[3]。IPMA具有特異性，敏感性結(jié)果與IFA相似。但此法在判定上有主觀性，且費(fèi)時(shí)，檢測(cè)價(jià)格貴。血清中和試驗(yàn)（SN）檢測(cè)PRRS 抗體特異性高，但因PRRS中和抗體出現(xiàn)晚而不適宜于早期診斷。Yoon等[4]人通過(guò)添加20%新鮮豬血清或豚鼠血清提高補(bǔ)體含量對(duì)SN 法進(jìn)行改良，能夠檢出感染后的9～11 d的抗體。PRRS中和抗體持續(xù)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，此法可用于PRRS后期診斷和區(qū)分PRRSV毒株。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)因其條件要求低，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，特異性敏感性高適用于基層獸醫(yī)工作，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于PRRSV抗體檢測(cè)。建立此項(xiàng)診斷技術(shù)的關(guān)鍵在于病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和病毒作為ELISA 抗原的純化處理。Cho 等[5]應(yīng)用Triton- X100 制備獲得高純度的ELISA 抗原，輔以高效封閉試劑，使該法具有高特異性、高敏感性和快速經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。此法優(yōu)于IMAP，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中PRRSV抗體的檢測(cè)。Seuberlich 等[6]報(bào)道了用競(jìng)爭(zhēng)ELISA來(lái)檢測(cè)PRRSV，同時(shí)與間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和傳統(tǒng)ELISA技術(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示其敏感性和特異性都很高，可以作為日常的診斷和監(jiān)測(cè)方法。

免疫膠體金技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的快速診斷技術(shù)，目前已有商品化的膠體金試紙出售，該法操作簡(jiǎn)單，診斷時(shí)間短，適合基層推廣使用，但是在基層使用中發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)，因此需要在檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度方面進(jìn)行提高，滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。

3 分子生物學(xué)診斷

PRRSV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括：反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RTPCR），核酸探針技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)。

RT-PCR 是檢測(cè)PRRS的主要手段。其原理是擴(kuò)增病毒特異而保守的基因片段，PRRSV 主要是擴(kuò)增ORF7。RT-PCR提供了一種良好的可替代細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)PRRSV 的方法。

Christopher 等[7]首先建立了檢測(cè)豬精液中PRRSV的RT-PCR方法，該方法快速、敏感、可靠、實(shí)驗(yàn)接毒92 d后，仍可從豬精液中檢測(cè)病毒RNA。在RT- PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的巢式PCR、定量Real-Time RT-PCR，巢式RT-PCR 均可用于PRRSV的檢測(cè)和定型，還提高了檢測(cè)的敏感性。

Sur 等[8]以PRRSV 的RNA為模板，通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增ORF7 中的433 bp 片段，應(yīng)用地高辛標(biāo)記方法制備PRRSV 特異性cDNA 探針，建立了檢測(cè)PRRSV原位雜交技術(shù)，該法可在肺、淋巴組織、肺泡巨噬細(xì)胞（尸體剖檢后灌洗獲得）、淋巴結(jié)、腎臟的感染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到PRRSV 的RNA，較免疫組化具有更高的敏感性和特異性，特別適合感染后期的細(xì)胞內(nèi)PRRSV的RNA的檢測(cè)。該方法不僅能夠證明豬體內(nèi)確實(shí)存在有PRRSV，而且能夠?qū)RRSV 在體內(nèi)器官中的動(dòng)態(tài)分布情況進(jìn)行追蹤檢測(cè)。

Lee 等[9]建立了基因芯片技術(shù)用于GP4 和GPS 對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)影響的研究。以Hela 細(xì)胞系為PRRSV GP5 蛋白穩(wěn)定的表達(dá)載體，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、Western 雜交和免疫沉淀試驗(yàn)均未觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；同時(shí)還檢驗(yàn)了Marc-145 細(xì)胞與HeLa 共同培養(yǎng)時(shí)GP5表達(dá)對(duì)Marc-145 細(xì)胞的影響也未發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的存在。使用細(xì)胞凋亡芯片檢測(cè)證實(shí)GP5 表達(dá)不能引起細(xì)胞凋亡，由于GP5 的表達(dá)與免疫反應(yīng)有關(guān)，因此其表達(dá)譜能用于PRRVS的診斷。

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