湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 陳佩佩 占今舜 閆景彩＊

黃酮類化合物是苜蓿中主要的生物活性成分之一，具有抗氧化清除自由基的作用，可以作為天然抗氧化劑。苜蓿黃酮還具有抗腫瘤、提高機體免疫力、延緩衰老、增強心血管功能，以及微量雌激素樣作用。本文就苜蓿黃酮的分類、含量影響因素、提取方法和生物學功能及其在禽生產(chǎn)中的應用作一綜述。

1 苜蓿黃酮的分類

苜蓿黃酮是苜蓿生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于苜蓿的莖葉中。苜蓿屬中的黃酮類成分約有80余種，來源于紫花苜蓿的有30余種，據(jù)報道苜蓿屬植物的黃酮類成分主要有以下幾種結(jié)構(gòu)類型：黃酮及其苷類、黃酮醇及其苷類、異黃酮類、異黃烷、查耳酮、二氫黃酮、二氫異黃酮和紫檀烷類等（何春年等，2006）。苜蓿屬中黃酮類成分的母核主要為芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黃素、美迪紫檀素山奈酚、槲皮素、楊梅黃素、蘆丁、燃料木黃酮、刺芒柄花黃素和大豆素等。其中芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黃素、刺芒柄花黃素、槲皮素、燃料木黃酮和美的紫檀素等母核的結(jié)構(gòu)均存在于紫花苜蓿中，并以芹菜素、木犀草素、苜蓿素最為常見。

2 影響苜蓿黃酮含量的因素

2.1 品種間的差異 由于自身的遺傳特性及對環(huán)境的適應性的不同，不同苜蓿品種間在總黃酮含量上也表現(xiàn)出比較顯著的差異。薄亞光等（2008）對6個紫花苜蓿品種莖、葉中總黃酮進行提取和測定，結(jié)果表明，各品種、株系總黃酮含量有差異，其中品種牧歌三葉型總黃酮含量最高，為7.08 mg/g，品種全能三葉型含量最低，為6.32 mg/g。徐文燕（2007）考察不同品種和采收季節(jié)紫花苜蓿中黃酮含量，結(jié)果表明，品種和采收季節(jié)對紫花苜蓿中的總黃酮含量均有明顯影響，并且不同品種中的總黃酮含量對季節(jié)變化的敏感性不同。

2.2 環(huán)境因素對苜蓿黃酮含量的影響 植物的次生代謝產(chǎn)物是其在長期的自然存在中選擇、變異和適應的結(jié)果，因此次生代謝產(chǎn)物的合成會受到環(huán)境因素的調(diào)控。目前研究表明，影響苜蓿黃酮合成的環(huán)境因子主要包括光照、溫度、CO2濃度、礦物質(zhì)營養(yǎng)和土壤水分等幾個因素。

光照和溫度是兩大影響因素，可以直接影響到黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，對植株中黃酮含量有明顯的調(diào)節(jié)作用。高光照、較低的平均溫度可以使黃酮類成分合成途徑中相關(guān)酶的活性大幅度提高，從而有利于黃酮類物質(zhì)的積累，故夏季植株中黃酮含量高于春季，在夏季收割提取為宜。CO2濃度是間接影響因素，主要通過影響黃酮類物質(zhì)前體的數(shù)量來影響其合成。礦物質(zhì)元素是作物生長所必需的，適量限制氮、磷肥的施用有利于黃酮類成分的積累。Strisse等（2005）研究報道，高氮降低蘋果葉片中總黃酮含量的機制在于使L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性下調(diào)，從而影響下游黃酮的合成。Stewart等（2001）對不同施肥狀態(tài)下的番茄進行了檢測，結(jié)果顯示，限制氮肥后，黃酮醇含量在番茄葉片中顯著增加；限制磷肥后黃酮醇含量在果實發(fā)育初期顯著增加。

3 苜蓿黃酮的提取、測定及分離方法

3.1 提取方法 目前苜蓿黃酮的提取方法，主要有索式提取法、有機溶劑浸提法、熱水浸提法、堿提酸沉法等幾種方法。

有機溶劑提取法是提取苜蓿黃酮的理想方法，常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，高體積分數(shù)的醇（90%～95%）適于提取苷元，體積分數(shù)60%左右的醇適合提取苷類（張研等，2008）。邢軍等（2008）利用乙醇提取苜蓿黃酮，通過單因素和正交試驗，確定乙醇提取苜蓿總黃酮的最佳條件為：浸提劑選用70%乙醇，料液比為1∶50，浸提溫度為80℃，浸提時間為4 h，浸提次數(shù)為2次。

但傳統(tǒng)的有機溶劑提取法耗時相對較長，近年來，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法廣泛應用于植物天然有效成分的提取，是很有發(fā)展前景的方法。鄧斌等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇浸提的基礎(chǔ)上，采用超聲波輔助技術(shù)提取苜蓿黃酮，萃取時間短、溶劑用量少、提取效率高、重現(xiàn)性好。馮濤等（2008）對苜蓿黃酮采用了加熱回流、索氏提取、超聲提取3種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取法提取黃酮可顯著提高黃酮得率，最佳提取工藝為：60%乙醇，30∶1 的液固比，提取 3 次，1 h/次。 張詠梅等（2008）采用微波輔助提取法提取苜蓿黃酮，結(jié)果表明，最佳提取工藝為：體積分數(shù)為40%乙醇，固液比為1∶30，微波500 W功率下作用60 s。3.2 測定方法 黃酮含量的測定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法、紙色譜PC和薄層色譜TLC法、熒光測定法、原子吸收光譜法、近紅外漫反射光譜法、共振散射光譜法、薄層掃描法和單掃示波極譜法等，其中最常用的就是紫外分光光度法和高效液相色譜法 （董彩軍和李鋒，2010）。

紫外分光光度法是以蘆丁為標準樣品，在其紫外最大吸收峰510 nm處測定試樣的吸光值與標準曲線比較并定量計算苜蓿黃酮含量。叢媛媛等（2006）采用紫外分光光度法測定了苜蓿黃酮的含量，結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性好，操作簡單，平均加樣回收率為96.2%，相對標準偏差為3.32%。紫外分光光度法可以定量的計算苜蓿中總黃酮的含量，但是此方法前處理復雜，需要對樣品進行純化。

高效液相色譜法具有分離效果好、準確性高、分析速度快，以及儀器自動化程度高等特點，尤其適合對揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大，以及離子型化合物的分析，已廣泛用于植物天然活性成分的分析。徐文燕等（2007）利用高效液相色譜法同時測定出苜蓿中幾種主要黃酮成分：芹菜素、苜蓿素和7，4’一二羥基黃酮。李存滿等（2006）采用高效液相色譜法測定苜蓿中苜蓿素的含量，較好的色譜條件為：色譜柱為Agilent Zorbox C18，流動相為甲醇-水（65∶35），流速為 0.8 mL/min，檢測波長為349 nm，進樣量為5 μL，溫度為室溫。

3.3 分離方法 關(guān)于黃酮類化合物的分離純化方法有很多，主要有薄層層析法、柱層析法、紙層析法、超臨界CO2萃取法和大孔樹脂吸附法等（宋秋華等，2007）。

大孔樹脂是近年來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，是依靠其和被吸附的分子（吸附質(zhì)）之間的范德華引力，通過其巨大的比表面進行物理吸附而工作的。其具有物化穩(wěn)定性高、吸附選擇性好、不受無機物存在的影響、再生簡單、解析條件溫和、使用周期長、易于構(gòu)成閉路循環(huán)及節(jié)省費用等優(yōu)點，廣泛用于物質(zhì)的分離純化。朱宇旌等（2008）采用大孔吸附樹脂HPH480對苜蓿異黃酮進行純化，動態(tài)吸附試驗結(jié)果表明，較好的動態(tài)吸附條件為：上樣液濃度0.6～1.2 mg/mL，上樣液pH 為 5，徑高比為 1∶20，預吸附 4 h，流速 2 mL/min，上樣液溫度40℃，采用體積分數(shù)80%的乙醇60℃洗脫，流速為1.0 mL/min，洗脫劑用量為4 BV（床容積），在此條件下得到的苜蓿異黃酮純度可在10%以上，較粗提物提高3倍以上。

4 苜蓿黃酮的生物學功能

4.1 抗氧化 朱宇旌等（2006）在豬油中加入不同比例紫花苜蓿黃酮粗提物，結(jié)果表明，添加苜蓿黃酮粗提物對豬油具有良好的抗氧化作用，但不如維生素C效果好；另外，維生素C和維生素E對苜蓿黃酮粗提物具有明顯的協(xié)同抗氧化作用，效果優(yōu)于單獨添加黃酮粗提物和維生素C。李寶蘭等（2009）研究報道，灌胃苜?？傸S酮的小鼠全血中的甘油三脂和低密度脂蛋白的含量明顯降低（P＜0.05），而高密度脂蛋白膽固醇含量升高；小鼠的肝臟和腎臟組織勻漿中過氧化物歧化酶的活性顯著升高（P＜0.05），丙二醛含量降低。這說明苜?？傸S酮具有降血脂、降低低密度脂蛋白膽固醇、預防和減緩動脈硬化的作用，同時還具有抑制氧自由基損傷防止脂質(zhì)過氧化的作用。黃酮類化合物抗氧化及消除自由基的機理主要包括兩個方面：一是絡合那些具有氧化作用的金屬離子，形成螯合物，從而降低金屬的氧化作用；二是能和自由基進行反應，從而消除某些自由基的氧化作用（鄭裕國等，2003）。

4.2 提高免疫力 吳健全等（2005）研究報道，苜蓿中的染料木黃酮可以提高輻射小鼠的免疫功能，在Csy射線照射試驗中，供給0.08%染料木黃酮的小鼠與正常小鼠比較，淋巴細胞增殖指數(shù)提高86.8%，血清溶血素含量提高90.9%，同時脾臟功能也有很大提高。這可能與染料木黃酮強烈抑制促癌劑TPA誘導的多形核細胞及HL-60細胞中H2O2的形成，并中等強度地抑制HL-60細胞中超氧陰離子自由基的產(chǎn)生有關(guān)。

4.3 抗腫瘤 Boue等 （2003）在乳腺癌細胞MCF-7增殖化驗中發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿甲醇提取物表現(xiàn)出了超過雌二醇的雌激素活性，可以誘導具有抑制細胞增殖作用的基因的表達。余小平等（2005）用 5 μmol／L的染料木黃酮處理乳腺癌細胞后，癌細胞中血管內(nèi)皮生長因子的mRNA和蛋白表達水平逐漸下降，表明染料木黃酮能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上降低乳腺癌的發(fā)病率。Wang等（1999）體外試驗研究表明，芹菜素對白血病細胞株HL-60具有抑制生長和誘導凋亡的作用。Fotsis等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可通過抑制腫瘤細胞分泌的促進血管生長的bFGF（堿性成纖維生長因子）活性降低其對血管內(nèi)皮細胞的刺激作用。Cai等（2005、2004）研究報道，在突變型 Apcmin鼠4～18周齡期間的飼糧中添加0.2%的苜蓿素，與對照組相比，患腸癌的機率降低了33%，進一步的試驗還發(fā)現(xiàn)苜蓿素可以抑制惡性胸腺癌細胞MDA-MB-468的生長。

4.4 類雌激素作用 研究證實苜蓿的雌激素作用活性，主要與其所含的異黃酮化合物有關(guān)。異黃酮化合物可以結(jié)合到雌二醇激素受體上，發(fā)揮雌激素樣作用，可以作為輔助治療用于低雌激素狀況，預防和治療骨質(zhì)疏松。苜蓿含有3種主要的植物雌激素：香豆雌酚、燃料木黃酮和forrnonetin，兩種次要的為大豆黃酮和biochaninA。香豆雌酚活性相當于雌二醇的5%，燃料木黃酮和forrnonetin分別為 1%和 0.01%（Noteboom，1963）。大豆黃酮、染料木黃酮等異黃酮可緩解去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松和脂肪代謝失調(diào)（Uesugi等，2001）。

5 在雞生產(chǎn)中應用

熊小文等（2012）研究飼糧中添加苜蓿黃酮提取物對崇仁麻雞母雛生長性能和養(yǎng)分利用率的影響，結(jié)果表明，苜蓿黃酮提取物在一定程度上提高了崇仁麻雞母雛平均日采食量、雞只的體重和日增重，并在第15～21 d達到顯著水平；降低了料重比，提高養(yǎng)分利用率；降低粗脂肪的利用率，提高鈣的利用率。說明日糧中添加適量的苜蓿黃酮提取物，能夠促進雞的生長，降低脂肪的沉積，改善胴體品質(zhì)，提高生產(chǎn)效益。周萍芳（2011）研究結(jié)果表明，在雞的日糧中添加含有黃酮300 mg/kg的苜蓿黃酮提取物，能夠降低麻雞血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、尿素氮和尿酸含量，提高高密度脂蛋白膽固醇含量；降低腹脂率、皮下脂肪厚度、肌間脂肪寬度和胸肌和腿肌中脂肪含量，提高胸肌和腿肌中蛋白質(zhì)含量；提高脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。說明日糧中添加適量的黃酮提取物可以提高麻雞的生產(chǎn)性能，提高營養(yǎng)物質(zhì)的代謝率，降低血脂，提高胴體品質(zhì)，降低腹脂率，改善免疫功能。另外，有研究表明，在肉仔雞的日糧中添加600 mg/kg的苜蓿素可以提高肉仔雞的生長性能，提高飼料轉(zhuǎn)化率（佟建明等，2004）。

6 小結(jié)

苜蓿屬植物資源豐富，分布范圍廣。但目前對苜蓿資源的利用主要以干草或草粉的形式作為畜禽飼料，少部分經(jīng)加工后作為飼料添加劑應用，對苜蓿中的活性物質(zhì)如黃酮的研究、開發(fā)和利用較少，僅局限于實驗室，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。隨著研究的不斷深入，生產(chǎn)技術(shù)的不斷成熟，相信苜蓿黃酮將會作為飼料添加劑廣泛應用于動物生產(chǎn)中。

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