楊林，邵文斌，于愛(ài)紅，束長(zhǎng)宇，朱家君，東建麗(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050)

蜆殼花椒Zanthoxylum dissitumHemsl.，又名單面針、山枇杷、大葉花椒、麻瘋刺、九牛藤、公麒麟、蚌殼花椒等［1］，屬蕓香科花椒屬攀援藤本植物［2］，在我國(guó)主要分布于甘肅、陜西、四川、貴州、廣西、廣東、湖南及湖北等省區(qū)［4］。根、莖及葉均可入藥，有祛風(fēng)活絡(luò)、散瘀止痛、解毒消腫之功效，民間用于治療腰腿、關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷等癥［4］。傳統(tǒng)中藥主要以水煎劑入藥，蜆殼花椒中水溶性多糖可能是藥物有效成分之一，而多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫受體，提高機(jī)體的免疫功能，在用于癌癥的輔助治療中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等優(yōu)點(diǎn)［5］。

近年來(lái)，對(duì)蜆殼花椒的研究報(bào)道較少，王麗萍等［6］、馬英姿等［7-12］、王平等［13-14］及王海霞等［15］對(duì)蜆殼花椒組織培養(yǎng)及生物學(xué)特性進(jìn)行了一系列研究，并發(fā)現(xiàn)蜆殼花椒資源日趨貧乏［7］。湯俊等［16］、韋瑀龍等［17］從蜆殼花椒干燥莖中分別得到8個(gè)化合物和6個(gè)生物堿類化合物，馬英姿等［18］從蜆殼花椒中性親脂性成分中分離得到6個(gè)化合物并具有多種生物活性，未見(jiàn)蜆殼花椒果皮多糖的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)蜆殼花椒果皮總多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為蜆殼花椒果皮多糖的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥材蜆殼花椒(采自甘肅省文縣碧峰溝，晾干，粉碎)。

1.1.2 試劑葡萄糖(分析純，天津市百世化工有限公司)，苯酚(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，濃硫酸(分析純，白銀良友化學(xué)試劑有限公司)，石油醚(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.1.3 儀器AB-105N電子天平(Mettler Toledo Group)，紫外分光光度計(jì)(Varian Australia RTY LTD);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水提醇沉法提取蜆殼花椒總多糖工藝流程原料粉碎→石油醚回流提取(100 mL/g)→過(guò)濾→濾渣→95%乙醇回流提取(100 mL/g)→過(guò)濾→烘干濾渣→熱水浸提→離心→上清液→濃縮→sevage法除蛋白→80%乙醇醇析→離心→干燥沉淀→粗多糖。

1.2.2 蜆殼花椒果皮多糖提取率的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取105℃下干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品0.100 0 g，加蒸餾水溶解，定容于250 mL量瓶中，配成0.4 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5 mL分別置于10 mL量瓶中，以蒸餾水定容，得系列對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取上述系列對(duì)照品溶液1.0 mL，分別置于10 mL比色管中，將比色管置于冰水中，分別向比色管加入1 mL苯酚試劑，再加入濃硫酸4 mL，待各管加完后同時(shí)搖勻，沸水加熱10 min，冷卻，定容至刻度，于490 nm測(cè)定吸光度值。另精密吸取蒸餾水1.0 mL，同法操作，作為空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=2.767 6x+0.006 9(r=0.999 4)，線性范圍為0～0.2 mg/mL。

1.2.3 多糖提取率的測(cè)定精密稱取脫脂并干燥的蜆殼花椒果皮粉末2.000 0 g熱水浸提，過(guò)濾，濾液定容至500 mL量瓶中，得供試品溶液。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含有量，精密吸取1 mL供試品溶液于10 mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備步驟操作，測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其濃度，并得出多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，分別在溫度為60、70、80、90、100℃，液料比為60∶1(mL/g)的條件下提取120 min，提取兩次，過(guò)濾，濾液冷卻后，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同，按多糖提取率的測(cè)定方法計(jì)算總多糖提取率。

1.2.4.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度篩選結(jié)果，以最佳提取溫度，液料比分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1的條件下提取120 min，提取兩次，過(guò)濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測(cè)定方法計(jì)算總多糖提取率。

1.2.4.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度及液料比篩選結(jié)果，分別以最佳提取溫度及液料比條件下提取60、90、120、150、180 min，提取兩次，過(guò)濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測(cè)定方法計(jì)算總多糖提取率。

1.2.4.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響精確稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度、液料比及提取時(shí)間篩選結(jié)果，以最佳提取溫度、液料比及提取時(shí)間條件下分別提取1、2、3、4次，過(guò)濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測(cè)定方法計(jì)算總多糖提取率。

1.2.5 響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝的優(yōu)化綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-benhken的中心組合設(shè)計(jì)原理［19-20］，采用響應(yīng)面法對(duì)蜆殼花椒果皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著提取溫度的升高而增加，至溫度在90℃時(shí)提取率最高，之后提取率隨著溫度的升高而下降，因此選擇最佳提取溫度為90℃，見(jiàn)圖1。

2.1.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著液料比的增大而增加，但在液料比80∶1之后提取率有下降趨勢(shì)，因此，選擇液料比為80∶1，見(jiàn)圖2。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)有所增加，在150 min之后趨于平緩?？紤]到時(shí)間越長(zhǎng)，能耗越大，因此，選擇最佳提取時(shí)間為150 min，見(jiàn)圖3。

圖1 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖2 液料比對(duì)提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，提取次數(shù)對(duì)提取率的影響比較小，提取兩次后，提取率趨于平緩，考慮到提取次數(shù)越多，能耗也越大，因此，選擇最佳提取次數(shù)為2次，見(jiàn)圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

由以上試驗(yàn)結(jié)果表明，蜆殼花椒果皮多糖各單因素最佳提取條件為:提取溫度為90℃，液料比為80∶1，提取時(shí)間為150 min，提取2次。

2.2 采用響應(yīng)面分析法對(duì)蜆殼花椒多糖提取工藝的優(yōu)化在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇對(duì)提取率影響較為顯著的提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)3個(gè)因素做響應(yīng)面分析，以X1=(Z1－90)/5、X2=(Z2－80)/10、X3=(Z3－150)/15為自變量，以多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，具體試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2中實(shí)驗(yàn)序號(hào)1～12為析因試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)序號(hào)13～17為中心試驗(yàn)。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。采用Design-Expert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程:Y=5.00+0.090X1+0.057X2－0.021X3+0.011X1X2－0.032X1X3－0.056X2X3－0.33X21－0.23X22－0.12X23。

回歸方程中X1、X2、X21、X22和X23對(duì)蜆殼花椒果皮多糖提取率影響極顯著，X2X3對(duì)提取率影響高度顯著，其他不顯著，表明各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)面值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)反映的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符情況，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果為不顯著，因此模型選擇正確。模型的F檢驗(yàn)結(jié)果為極顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.993 3，表明該回歸方程模型擬合程度非常好。CV=0.64%，數(shù)據(jù)較低，表明實(shí)驗(yàn)操作可信，以上回歸分析表明可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)蜆殼花椒果皮多糖最佳提取工藝條件。見(jiàn)表3，表4。

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖，如圖5～7。在描述任意兩因素間的關(guān)系時(shí)，當(dāng)固定其中一個(gè)因素不變，試驗(yàn)初期隨另一因素的增大多糖提取率提高，但達(dá)到一定程度后多糖提取率反而降低，響應(yīng)面試驗(yàn)規(guī)律與單因素試驗(yàn)基本一致。圖5～7所示，溫度和液料比對(duì)多糖提取率的影響均顯著，變化幅度較大，提取時(shí)間的曲線較平緩，表明其對(duì)多糖提取率的影響較小。從等高線圖可以看出，三個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)多糖提取率影響大小，與方差分析結(jié)果一致。

表3 回歸方程的方差分析

表4 模型的可信度分析

2.3 模型的驗(yàn)證有響應(yīng)面法分析可知，熱水浸提蜆殼花椒果皮多糖的最佳工藝為:提取溫度為94.28℃，液料比為81.72∶1，提取時(shí)間為146.48 min，在此條件下的多糖提取率為4.85%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行蜆殼花椒果皮多糖的提取試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際情況，將提取工藝參數(shù)修正為:提取溫度為94℃，液料比為82∶1，提取時(shí)間為146 min，提取2次，在此條件下做三組平行試驗(yàn)，測(cè)得平均提取率為4.99%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其誤差約為2.87%，在可接受范圍內(nèi)。

圖5 提取溫度(X1)與液料比(X2)對(duì)提取率(Y)的響應(yīng)面與等值線

圖6 提取溫度(X1)與提取時(shí)間(X3)對(duì)提取率(Y)的響應(yīng)面與等值線

圖7 液料比(X2)與提取時(shí)間(X3)對(duì)提取率(Y)的響應(yīng)面與等值線

3 結(jié)論

采用水提醇沉法提取蜆殼花椒果皮總多糖，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，使蜆殼花椒多糖的提取率最大化。經(jīng)模型分析并修正后，蜆殼花椒果皮多糖的最佳提取工藝為:提取溫度為94℃，液料比為82∶1，提取時(shí)間為146 min，提取2次，得出蜆殼花椒多糖平均提取率高達(dá)4.99%。采用響應(yīng)面法分析提取工藝，不但可優(yōu)化出最佳工藝，而且可以對(duì)提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)，其數(shù)據(jù)處理更加簡(jiǎn)便、科學(xué)。

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