張林東，李菲，曾靈娜，向誠，李寶才*，李鵬，2*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650224;2.(澳門大學(xué))中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門999078)

柱切換(column switching)色譜技術(shù)又名色譜-色譜聯(lián)用技術(shù)或多維色譜技術(shù)(multi-dimensional chromatography)［1］，是在普通的HPLC裝置中接入一個(gè)切換閥(六通閥或十通閥)實(shí)現(xiàn)不同流路之間的相互切換，而達(dá)到所需的分離分析目的。柱切換技術(shù)具有在線凈化、濃縮樣品、簡化樣品預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、農(nóng)藥殘留監(jiān)測等領(lǐng)域［2］，但在中藥化學(xué)成分分析及定量分析領(lǐng)域應(yīng)用較少，因此把此技術(shù)應(yīng)用于道地中藥的質(zhì)量控制以及中藥材替代品的尋找和質(zhì)量控制有一定意義。

鼠尾草屬Salvia是唇形科Lamiaceae鼠尾草族Salvieae中最大的一個(gè)屬，全世界約1 050種，廣布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，我國大部分地區(qū)均有分布［3］。由于該屬植物種類較多、分布廣、變異大，形態(tài)特征相近，種間區(qū)分困難，造成其系統(tǒng)分類、品種鑒定及資源利用一直較為混亂［4］。該屬多種植物常作為丹參的替代品使用。丹參含有水溶性和脂溶性的兩大類有效成分。水溶性成分主要為原兒茶醛、丹參素、丹酚酸等多聚酚酸類成分［5］，具有消除自由基、保護(hù)胃黏膜［6］等藥理作用。脂溶性成分為隱丹參酮、丹參酮IIA等多種菲醌類物質(zhì)［3］，藥理作用主要體現(xiàn)在抗菌消炎，抗腫瘤和組織修復(fù)等［7-10］上。本實(shí)驗(yàn)主要利用雙柱切換技術(shù)［11］實(shí)現(xiàn)對(duì)該屬植物水溶性和脂溶性成分分別在不同色譜柱上進(jìn)行定性、定量分析，為鼠尾草屬植物中復(fù)雜化學(xué)成分分析提供一個(gè)更好的方法，為鼠尾草植物資源的科學(xué)評(píng)價(jià)和綜合利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng):G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD檢測器，預(yù)吸附柱Megres-C18色譜柱(4.6 mm×10 mm，5 μm)，色譜柱1為Agilent Zorbax Sb-Aq色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，色譜柱2為Agilent Eclips XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，MXP9960-000二位十通高壓切換閥(美國Rheodyne)，0.25 μm PEEK管，T2000Y型電子天平(美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司)，CP-214電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 試藥正品丹參藥材購自云南一心堂中藥房，其他3種鼠尾草均采自麗江，4種藥材經(jīng)云南省中醫(yī)中藥研究院郭世民研究員鑒定分別為丹參Salvia miltiorrhiza，云南鼠尾草Salvia yunnanensis C.H.Wright，甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim，栗色鼠尾草Salvia castanea Diels。丹參素、丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 供試樣品溶液的制備將藥材充分曬干后，鼓風(fēng)干燥12 h，粉碎，過60目篩。取生藥粉1.0 g，精密稱定，精密加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。搖勻，靜置，取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液作為供試樣品溶液。

2.1.2 提取工藝加樣回收率試驗(yàn)樣品制備精密移取一定量的各對(duì)照品溶液置于燒杯中，揮干，然后稱取1.000 g丹參藥材置于燒杯中按照2.1.1項(xiàng)中供試樣品的制備方法，提取藥材制備提取工藝加樣回收率試驗(yàn)樣品。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取丹參素6.0 mg，其他對(duì)照品均精密稱取4.0 mg。丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸分別加到不同10 mL量瓶中甲醇定容。將隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA加入到同一個(gè)10 mL量瓶中，再從上述定容的4種對(duì)照品溶液中分別移取1.00 mL，甲醇定容制成混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2 色譜條件柱溫為25℃;體積質(zhì)量1.0 mL/min;0～15 min檢測波長(λ)為210 nm，15～70 min為275 nm(根據(jù)不同物質(zhì)的特征吸收波長不同選擇)，DAD檢測器在190～600 nm掃描紫外譜圖;流動(dòng)相為A(0.5%磷酸)-B(乙腈)，0～40 min在色譜柱1分析，40～70 min在色譜柱2進(jìn)行分析。柱切換梯度洗脫程序見表1。

2.3 樣品測定采用2.2項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行分析，樣品中與對(duì)照品對(duì)應(yīng)的色譜峰，通過與對(duì)照品色譜圖的保留時(shí)間和DAD檢測器掃描的紫外譜圖比對(duì)確定。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取2.1.3項(xiàng)方法配制的混合對(duì)照品溶液稀釋成丹參素為0.3、0.6、2.4、15、60 μg/mL，原兒茶醛和原兒茶酸均為0.2、0.4、1.6、10、40 μg/mL，咖啡酸為0.8、1.6、10、20、40 μg/mL，隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA均為2、4、16、100、400 μg/mL的不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，以實(shí)驗(yàn)方法中色譜條件進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，各成分在一定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表1 柱切換梯度洗脫程序Tab.1 The gradient program of the column switching HPLC method

2.3.2 最低檢測限(LOD)和最低定量限(LQD)取2.1.3項(xiàng)配制的混合對(duì)照品溶液稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在選定的色譜條件下，按信噪比(S/N)為3和10分別作為最低檢測限和最低定量限，結(jié)果見表2。

表2 回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍，檢出限及定量限Tab.2 Regressive equation，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ

2.3.3 提取工藝回收率實(shí)驗(yàn)取2.1.2項(xiàng)中制備的丹參加樣提取樣品分別按照2.2項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行分析，3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，以3次平均值計(jì)算回收率，回收率均在95.23%～98.48%之間，精密度RSD均在0.5%～1.5%之間，見表3。

2.3.4 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)取2.1.3項(xiàng)中配制的混合對(duì)照品貯備液稀釋為丹參素15.0 μg/mL，原兒茶醛、原兒茶酸和咖啡酸均為10.0 μg/mL，隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA均為100.0 μg/mL的對(duì)照品溶液做樣品日內(nèi)、日間精密度，回收率實(shí)驗(yàn)。取對(duì)照品溶液于同日連續(xù)進(jìn)樣5次測定日內(nèi)精密度，取對(duì)照品溶液連續(xù)3日，每日進(jìn)樣2次，共6次，測定日間精密度。精密度RSD均在0.12%～0.71%之間，回收率均在95.87%～102.31%之間。

2.3.5 4種鼠尾草屬植物中7種成分的測定按照2.1.1項(xiàng)制備供試樣品溶液，用建立的柱切換高效液相色譜技術(shù)能很好地分離和分析4種鼠尾草屬植物中的4種水溶性成分(丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸)和3種脂溶性成分(隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA)，參照2.3項(xiàng)確定分析物質(zhì)在色譜圖中位置，對(duì)照品及甘西鼠尾草提取液的HPLC圖譜見圖1，7個(gè)指標(biāo)成分的測定結(jié)果見表4。

表3 提取工藝加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.3 Recoveries of seven components in Savia miltiorrhiza

圖1 對(duì)照品(A)及甘西鼠尾草提取液(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of referance substances(A)and methanol extract of Salvia przewalskii Maxim(B)

表4 4種鼠尾草屬植物中7種化學(xué)成分Tab.4 Contents of seven components in four plants of Salvia

3 討論

3.1 柱切換條件的選擇本實(shí)驗(yàn)的目的是利用柱切換技術(shù)實(shí)現(xiàn)更多化學(xué)成分的分離，得到分離度好，色譜峰多的色譜圖，因此，流動(dòng)相種類、比例和柱切換時(shí)間的選擇是重要因素。

3.1.1 流動(dòng)相的選擇為了減弱提取物中酚酸類物質(zhì)的的拖尾現(xiàn)象和柱切換時(shí)系統(tǒng)峰和基線的影響，流動(dòng)相選擇了乙腈－0.5%磷酸水溶液體系。

3.1.2 柱切換時(shí)間的選擇因?yàn)橹袚Q過程中存在系統(tǒng)死體積，為了使色譜圖顯現(xiàn)更多的化學(xué)成分，切換時(shí)間和切換時(shí)流動(dòng)相比例的選擇可以避免分析過程中成分的損失，最終確定在40 min，磷酸水溶液比例為28%時(shí)進(jìn)行切換。

3.2 結(jié)果分析通過選定色譜條件對(duì)4種鼠尾草屬植物中7種成分定量結(jié)果顯示在4種植物中4種水溶性成分除咖啡酸外，含有量均為丹參＞云南鼠尾草＞甘西鼠尾草＞栗色鼠尾草，云南鼠尾草中部分水溶性成分含有量與丹參藥材相當(dāng)，脂溶性成分含有量云南鼠尾草除丹參酮I高于丹參外，另外兩組分含有量相當(dāng)，甘西鼠尾草和栗色鼠尾草三組分均遠(yuǎn)高于丹參藥材，因此得出云南鼠尾草可作為丹參替代藥材使用，甘西鼠尾草和栗色鼠尾草在作為丹參藥材使用時(shí)應(yīng)選擇性的與其他中藥材配伍使用。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)采集樣品進(jìn)行分析。中藥材受采集時(shí)間，生長環(huán)境等影響，其有效成分會(huì)存在差異，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅供參考。

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