何梅鳳，吳偉，唐細(xì)蘭，陳雷宇，陳茂玲(中山大學(xué)中山眼科中心，廣東廣州510060)

知柏八味口服液是根據(jù)中醫(yī)眼科中的慢性炎癥特征，在知柏地黃丸［1］處方基礎(chǔ)上進(jìn)行藥味加減及劑型改變而成，含知母、黃柏、牡丹皮、生地等八味中藥，具有滋陰降火，補(bǔ)腎明目的功效，用于治療腎陰不足，水虧火旺的眼病;視網(wǎng)膜靜脈周圍炎，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變，慢性葡萄膜炎，慢性結(jié)膜炎及干眼癥等，效果滿意［2］。方中君藥知母與黃柏，為苦寒清熱之品，是常用配伍藥對(duì)，芒果苷是知母清熱作用的主要有效成分，鹽酸小檗堿既是黃柏的指標(biāo)成分又是活性成分［3］，兩者起到相輔相成的作用［4］;丹皮酚是牡丹皮的主要有效成分，具有抗菌、抗炎等藥理作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)通過建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定上述3種成分的含有量，較好地解決原質(zhì)量指標(biāo)體系不完善等缺陷，有效控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括G1314A紫外檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，G1329A帶溫控自動(dòng)進(jìn)樣器，G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(jī)(美國(guó)安捷倫公司);Agilent 1100化學(xué)工作站;BT125D電子天平(北京賽多利斯有限公司)。知柏八味口服液(本中心制劑，粵藥制字Z20071453);芒果苷(批號(hào):111607-200402)、鹽酸小檗堿(批號(hào):110713-200911)、丹皮酚(批號(hào):110708-200506)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);水為超純水;乙腈為色譜純;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司);流動(dòng)相為乙腈(A)-33 mmol/L磷酸二氫鉀(B)，采用梯度洗脫，O～9 min，5%A，9～22 min，11%A，22～27 min，11%～28%A，27～32 min，28%A，32～35 min，28%～31%A，35～40 min，31%A，40～50 min，31%～42%A;柱溫50℃;體積流量0.9 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)317 nm;進(jìn)樣量40 μL。在上述色譜條件下，供試品中芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚色譜峰與相應(yīng)對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，其他組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備分別取芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為25.76、53.31、29.31 μg/mL的混合溶液，作為混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取一定體積的混合對(duì)照品貯備液于量瓶中，加流動(dòng)相稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備精密量取供試品1 mL，置50 mL量瓶中，加水至定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備按知柏八味口服液處方比例，稱取除知母、黃柏和牡丹皮的各味藥材，制得樣品，再按供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，得各系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定組分峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芒果苷回歸方程為A=93.033 2 C+3.191 4(r=0.999 9);鹽酸小檗堿回歸方程A=64.671 0 C+3.592 0(r=0.999 9);丹皮酚回歸方程A=92.262 3 C+4.291 1(r=0.999 8);表明芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚分別在1.288～12.88 μg/mL，2.666～26.655 μg/mL和1.466～14.655 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積，計(jì)算得芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.9%、0.8%、1.1%。表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密量取同一批知柏八味口服液(批號(hào)120205)共6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚含有量的RSD分別為1.8%、1.1%和1.3%。表明本法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(批號(hào)120205)每隔2 h進(jìn)樣測(cè)定1次，共進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚峰面積的RSD分別為2.1%、1.7%和1.4%。結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)精密量取知柏八味口服液(批號(hào)120205)0.5 mL，共9份(3份1組)，分別置于50 mL量瓶中，各組分別加入混合對(duì)照品貯備液3.0、4.0、5.0 mL，加水至定容，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液40 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。2.10樣品測(cè)定分別取3批樣品，每批平行3份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算供試品中芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests of samples(n=9)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of samples(n=3)

3 討論

3.1 知柏八味口服液作為復(fù)方制劑，所含化學(xué)成分復(fù)雜且極性相差較大，采用乙腈-水或乙腈-磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相等度洗脫，難以將待測(cè)組分與樣品中其他組分達(dá)到基線分離。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，以及通過優(yōu)化體積流量和調(diào)節(jié)柱溫為50℃，可將3個(gè)目標(biāo)峰有效分離，且無(wú)其他峰干擾，效果較滿意。

3.2 芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚的測(cè)定波長(zhǎng)多分別采用317、265 nm和274 nm［7-12］，由于知柏八味口服液中小檗堿和丹皮酚的色譜響應(yīng)值較大，為了縮小3種成分吸收強(qiáng)度的差別，且不影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，經(jīng)試驗(yàn)，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為317 nm，3者的吸收峰均較好。

3.3 尚未見同時(shí)測(cè)定芒果苷、鹽酸小檗堿和丹皮酚的報(bào)道，本試驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定知柏八味口服液中上述3種有效成分的含有量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:820-821.

［2］甄棟欽，溫樹東，陳亞發(fā).知柏八味口服液治療眼科慢性炎癥驗(yàn)案3則［J］.新中醫(yī)，2000，32(10):52.

［3］易博，孫赫，原源，等.RP-HPLC法測(cè)定知母黃柏藥對(duì)中新芒果苷、芒果苷和鹽酸小檗堿［J］.中草藥，2007，38(6):856-858.

［4］李學(xué)堅(jiān)，鄧家剛，覃振林，等.芒果苷、小檗堿組合物抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2010，17(1):36-37.

［5］楊正生，彭振輝，姚青海，等.丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥物與臨床，2011，11(5):545-547.

［6］潘政，張洪波.丹皮酚軟膏治療瘙癢病60例［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2011，10(4):244-245.

［7］張登山，周琴妹.滋腎通關(guān)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立［J］.中國(guó)藥師，2010，13(5):672-674.

［8］翟紅莉，孫連娜，來(lái)威，等.HPLC法測(cè)定知母藥材及其相關(guān)制劑中芒果苷和新芒果苷的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(6):472-474.

［9］李學(xué)堅(jiān)，鄧家剛，覃振林，等.復(fù)方芒果苷滴眼液中芒果苷和鹽酸小檗堿的鑒別及含量測(cè)定［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25(1):118-119.

［10］張莉，潘超.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定二妙丸中鹽酸小檗堿和黃柏堿的含量［J］.中國(guó)新藥雜志，2011，20(22):2262-2264.

［11］鮮潔晨，張寧，馮怡.六味地黃丸質(zhì)量差異分析［J］.中成藥，2009，31(6):882-886.

［12］李向陽(yáng)，屠萬(wàn)倩.RP-HPLC法測(cè)定六味地黃丸中丹皮酚、芍藥苷和烏蘇酸［J］.中成藥，2012，34(2):277-282.