張升 蔡國響 綜述 蔡三軍 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是常見的消化道惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約120萬例。Peyrin-biroulet等［1］報(bào)道，根據(jù)2008年衛(wèi)生部流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料，中國每年新發(fā)病例已超過17萬，發(fā)病率為31.39/10萬。Compton等［2］報(bào)道，結(jié)直腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的10.49%，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是主要的死亡原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶標(biāo)信使RNA(messenger RNA，mRNA)特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶標(biāo)mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控［3］。研究表明，其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)，尤其是細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)錄抑制、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及凋亡方面具有重要作用，人類大約30%以上的基因受miRNA調(diào)節(jié)［4］。當(dāng)前，腫瘤被認(rèn)為是一種既與基因改變有關(guān)也與表基因改變有關(guān)的疾病，表觀遺傳學(xué)研究內(nèi)容包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及miRNA在內(nèi)的非編碼RNA介導(dǎo)的基因改變［5］。本文將結(jié)合表觀遺傳學(xué)對(duì)miRNA在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 研究方法

1.1 miRNA檢測方法

許多學(xué)者通過高通量組學(xué)技術(shù)，如基因芯片(microRNA array)等在結(jié)直腸癌組織以及配對(duì)正常組織中檢測并比較差異表達(dá)的miRNA，挑選若干個(gè)候選miRNA作為研究對(duì)象，然后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量檢測表達(dá)來驗(yàn)證。檢測方法主要包括定量PCR、Northern blot等。Michael等［6］通過比較結(jié)直腸腺癌以及正常黏膜，發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145在癌組織中表達(dá)下調(diào)，接著Volinia等［7］采用miRNA芯片對(duì)比正常組織，篩查出一批在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高的miRNA，包括miR-21、miR-17-5p、miR-191、miR-29b、miR-223、miR-128b、miR-24、miR-155、miR-20a、miR-107、miR-32、miR-30c、miR-221和miR-106a等。Driskell等［8］建立了表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)，與常規(guī)的定量PCR相比，該方法有較高靈敏度和精確度，能檢測含量極低的miRNA，并能有效區(qū)分不同類型miRNA。Kato［9］建立了一種新的熒光DNA探針，該方法具有高度特異性，可以不通過電泳而直接區(qū)分miRNA前體和成熟的miRNA。這些研究說明對(duì)于miRNA的檢測方法在不斷進(jìn)步，并且還有很大的提升空間。

1.2 檢測DNA甲基化狀態(tài)的常用方法

DNA甲基化狀態(tài)分析的方法按其原理的不同，可以分為依賴于DNA序列分析的檢測技術(shù)、依賴于對(duì)5-甲基胞嘧啶敏感的限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)、依賴于甲基化芯片和質(zhì)譜檢測的技術(shù)等，前兩種也稱為甲基化分型，主要是針對(duì)較少位點(diǎn)檢測；后一種也稱為甲基化組學(xué)，則是針對(duì)較廣范圍甚至全基因組的甲基化分析［10］。依賴于DNA序列分析的檢測技術(shù)包括：甲基化特異性PCR(msp)、定量甲基化特異性PCR(qMSP)、焦磷酸鹽測序、BSP、高分辨率溶解曲線法(HRM)等［11-13］。各種方法原理不同，靈敏度和特異度也有所差異，所需要的檢測成本也不同。甲基化特異性PCR主要是用于甲基化定性研究，靈敏度高但特異性差，現(xiàn)在應(yīng)用逐漸減少，其余均為甲基化定量的研究。研究中主要是根據(jù)所檢測基因甲基化位點(diǎn)的多少以及對(duì)甲基化數(shù)據(jù)的精確度要求，從實(shí)際情況出發(fā)挑選合適的方法。

2 甲基化調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)

DNA的甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，miRNA以及DNA甲基化都與腫瘤的形成有密切的聯(lián)系［14］。在哺乳動(dòng)物中，DNA的甲基化發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上，CpG按一定的含量成簇地出現(xiàn)形成CpG島，人類基因組中大約包括38 000個(gè)CpG島，70%已知基因的5'端調(diào)節(jié)區(qū)有CpG島存在［15］。而人類miRNA編碼基因中約有47%與CpG島相關(guān)［16］。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域里，關(guān)于甲基化調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)的研究越來越多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與結(jié)直腸癌相關(guān)的miRNA存在甲基化調(diào)節(jié)機(jī)制［17-19］，其機(jī)理是miRNA基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，影響靶基因調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響癌癥通路的發(fā)生。Bandres等［20］研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-1、miR129-2、miR-137基因在腸癌組織中甲基化比率顯著高于癌旁正常組織，在癌組織中分別是56%(20/36)、91%(31/34)、100%(31/31)；在正常組織中分別為0、12%(4/34)、23%(7/31)。其中miR-9的表達(dá)與其基因甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。Balaguer等［21］采用去甲基化試劑5-Aza-CdR處理HCT116、LOVO等腸癌細(xì)胞株，比較干預(yù)前后miR-137基因啟動(dòng)子甲基化水平以及表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)去甲基化可以使miR-137表達(dá)激活。這些研究都為進(jìn)一步探討miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色提供了理論依據(jù)。

3 miRNA及其基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸癌預(yù)后判斷中的價(jià)值

3.1 早期診斷

Lu等［22］通過比較癌與正常組織中的一些miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在鑒別分化較差的腫瘤中，檢測miRNA比mRNA具有更高的準(zhǔn)確性。另外，miRNA比mRNA更穩(wěn)定，能通過血清以及糞便等體液檢測出來，故檢測方法的可行性高［23-24］。Cheng等［25］檢測102例結(jié)直腸癌患者血清中的miR-141水平，發(fā)現(xiàn)其水平升高提示不良預(yù)后，聯(lián)合CEA檢測能提高結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移診斷的準(zhǔn)確性。Kalimutho等［26］通過篩查并檢測結(jié)直腸癌患者糞便中特異性miRNA基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)miR34-b/c以及miR-148a基因啟動(dòng)子過度甲基化分別可以作為結(jié)直腸癌早期篩查以及隨訪的生物學(xué)標(biāo)志。在結(jié)直腸癌中，miR137基因甲基化是一個(gè)早期事件，其在癌組織中的甲基化程度明顯高于正常組織，因此可以作為結(jié)直腸癌早期篩查的一個(gè)分子標(biāo)記物［21］。Ng等［27］通過檢測并比較結(jié)直腸癌患者與健康人群外周血中的miR-92a表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者血清中miR-92a表達(dá)水平顯著升高，提示檢測外周血miR-92a水平可以作為一種篩查結(jié)直腸癌的無創(chuàng)性方法。這些研究表明，miRNA及其基因啟動(dòng)子甲基化的檢測在臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用空間，在組織中發(fā)現(xiàn)特異性的miRNA表達(dá)或其基因啟動(dòng)子甲基化差異，通過外周血或者代謝物檢測，從而實(shí)現(xiàn)其篩查以及早期診斷某些相關(guān)疾病的臨床價(jià)值。

3.2 判斷預(yù)后

通過檢測某些與結(jié)直腸癌相關(guān)的miRNA表達(dá)水平或者其基因甲基化水平可以判斷預(yù)后。Bandres等［20］在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中通過去甲基化干預(yù)，發(fā)現(xiàn)miR-9表達(dá)水平與其啟動(dòng)子CpG島甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步在組織標(biāo)本中研究，發(fā)現(xiàn)高甲基化與較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)；Lujambio等［28］在207例結(jié)直腸癌病例中同樣證實(shí)了此觀點(diǎn)，即miR-9啟動(dòng)子高甲基化提示不良預(yù)后。Tang等［29］研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中miR-345的CpG島表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，其表達(dá)水平顯著降低，深入研究揭示miR-345低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及較差的組織學(xué)類型存在相關(guān)性。幾項(xiàng)不同研究均發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-21與不良預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)為其在癌組織中表達(dá)高于正常組織，高表達(dá)與較高淋巴結(jié)陽性率、較高TNM分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)［30-32］。Shibuya等［32］在156例配對(duì)結(jié)直腸癌和正常組織中檢測miR-155表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平與無病生存率以及總生存率呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)與較高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)，提示預(yù)后不良。Akcakaya等［33］通過芯片篩選，比較不同預(yù)后兩組結(jié)直腸癌組織中miRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-185以及低表達(dá)miR-133b與預(yù)后不良相關(guān)，表現(xiàn)為較短的總生存和較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，提示兩者可以作為結(jié)直腸癌根治術(shù)后預(yù)后判斷的指標(biāo)，從而更好指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

3.3 化療療效預(yù)測

Nakajima等［34］研究46例復(fù)發(fā)或者帶瘤生存的患者結(jié)直腸癌組織以及21例配對(duì)正常組織中的hsa-let-7g和hsa-miR-181b表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)均高于正常組織，相比高表達(dá)者，低表達(dá)者對(duì)S1有較好的化療療效，但對(duì)總生存無影響。Rossi等［35］通過體外實(shí)驗(yàn)觀察到，抗代謝藥物5-FU能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和HT-29部分miRNA表達(dá)改變，包括miR-200b在內(nèi)的3種miRNA表達(dá)下調(diào) 和包含miR-21在內(nèi)的19種miRNA表達(dá)上調(diào)。由于目前許多miRNA的靶基因尚不明確，只能通過網(wǎng)站(picTar、targetScan等)和生物信息學(xué)整合來預(yù)測，目標(biāo)范圍較廣，而抗腫瘤藥物誘導(dǎo)miRNA表達(dá)改變以及miRNA改變化療敏感性的作用機(jī)制尚不清楚，故還需要進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色受到越來越多研究者的關(guān)注，結(jié)合表觀遺傳學(xué)探討其表達(dá)調(diào)節(jié)也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。然而，大部分研究發(fā)現(xiàn)僅是一種宏觀上的較小樣本量回顧性分析，缺乏前瞻性研究以及體外細(xì)胞株功能論證等證據(jù)，故將miRNA以及甲基化的研究結(jié)果大范圍地應(yīng)用于臨床實(shí)踐為時(shí)尚早。

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