楊莉 李聰 綜述 徐燁 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬新發(fā)病例，大量患者死于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。盡早預(yù)測患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，選擇合理的個(gè)體化治療方案，動態(tài)監(jiān)測疾病進(jìn)展過程，這些對于改善CRC患者的預(yù)后極其重要。

目前應(yīng)用于臨床的方法都不令人滿意。如何能較早準(zhǔn)確評估患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，將同一分期但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)不同的病人進(jìn)行區(qū)分，從而及時(shí)選擇合理的治療方案是目前亟待解決的問題。

外周血中儲存了大量的核酸和炎癥免疫等預(yù)后相關(guān)的信息，并且 不受標(biāo)本收集、無法連續(xù)檢測和隨訪等諸多因素的腫瘤組織學(xué)限制，具有潛在的研究及臨床應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)將CRC外周血預(yù)后相關(guān)因子的研究對象、主要方法、已有成果和存在問題作一綜述。

1 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞

目前將循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)定義為起源于原位腫瘤或者轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞，在明顯的轉(zhuǎn)移出現(xiàn)之前，局部的腫瘤可能發(fā)動CTC進(jìn)入外周循環(huán)，CTC本身具有或者獲得了逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)并且到達(dá)遠(yuǎn)處器官的作用，與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［1-2］。Rahbari等［3］評估了CRC患者外周血中CTC和預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果證實(shí)CTC是潛在的CRC預(yù)后標(biāo)志物。

CTC的檢測方法主要有密度梯度離心、免疫磁珠選擇、聚合酶鏈反應(yīng)以及流式細(xì)胞儀技術(shù)等，這些技術(shù)顯著推動了外周血中數(shù)量稀少的CTC的研究。

為了提高檢測的敏感性和特異性, 近年來的文獻(xiàn)中多使用富集與檢測技術(shù)相結(jié)合的自動化檢測系統(tǒng)，使用最多的是Cell Search檢測系統(tǒng)。Cell Search系統(tǒng)是目前唯一通過美國FDA批準(zhǔn)用于臨床的CTC檢測技術(shù)，該技術(shù)被認(rèn)為是CTC計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。

但是CellSearch檢測系統(tǒng)存在以下問題：

⑴CK19、CK20 mRNA等常用的CTC檢測標(biāo)志物其實(shí)是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，所測得的CTC結(jié)果實(shí)際是循環(huán)上皮細(xì)胞(circulating epithelial cells，CepC)。

⑵CTC脫離母體后，可能經(jīng)歷自我變異，所表達(dá)的上皮成分會減少甚至丟失。例如，EpCAM被認(rèn)為是CRC組織的特征抗原，用EpCAM包被的抗體來富集CTC的方法是免疫分離技術(shù)常用的方法，目前認(rèn)為，EpCAM在腫瘤侵襲過程發(fā)生的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中表達(dá)下降，導(dǎo)致CTC的基因表型與原發(fā)灶不一致［5］。若用傳統(tǒng)的標(biāo)志物檢測CTC，可能漏掉侵襲轉(zhuǎn)移力最高的CTC。

此外，針對CTC基因組的分析，Barbazan等［6］指出TIMP1、VCL、ITGB5、BMP6、TGFb1和CLU等CTC特異基因的表達(dá)與CRC的診斷及預(yù)后相關(guān)。這些特征基因涉及了腫瘤細(xì)胞侵襲表型的獲得、粘附和遷移等多個(gè)方面。其中，CTC中TIMP1的表達(dá)和CRC肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)，是肝臟微環(huán)境的調(diào)節(jié)因子，增加了器官對于腫瘤細(xì)胞的易感性［6-7］。

目前，大多數(shù)的研究都是圍繞著CTC的特異基因展開，目的是尋找到高度特異的CTC標(biāo)志物。今后，在建立標(biāo)準(zhǔn)的CTC檢測方法的基礎(chǔ)上，針對CTC分子特征進(jìn)行研究，確定其生物學(xué)行為及作用機(jī)制，從而為針對CTC的腫瘤靶向治療提供依據(jù)，將是腫瘤研究的一個(gè)新領(lǐng)域。

2 外周血循環(huán)核酸

在多種腫瘤患者的外周血循環(huán)核酸中存在腫瘤特異的或與腫瘤相關(guān)的改變。血漿和血清中的循環(huán)核酸的產(chǎn)生不僅是通過細(xì)胞裂解，也可以通過細(xì)胞的活性分泌［8］。

大量研究顯示，外周血中游離的DNA量在腫瘤良惡性、分期、治療后變化和患者生存期等方面都有意義。通過檢測外周血游離核酸水平有助于初步篩查CRC患者、判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及評估療效和預(yù)后。

在CRC及其微轉(zhuǎn)移的早期，外周血中CEA mRNA比CEA 蛋白更早地出現(xiàn)升高，且CEA mRNA水平變化與CRC的分期、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，定量檢測外周血CEA mRNA水平可作為CRC輔助診斷和監(jiān)測微轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)［9-10］。這提示外周血中CEA mRNA水平可能與CRC患者預(yù)后相關(guān)。

細(xì)胞來源的miRNAs在外周血中穩(wěn)定的存在，免于被內(nèi)源性的RNase活性所降解。由于具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，它們的出現(xiàn)引起了研究者的注意。Ng等［11］報(bào)道了循環(huán)miRNAs可能是潛在、非侵入性的CRC的分子標(biāo)志物。Pu等［12］直接用血漿進(jìn)行miRNAs擴(kuò)增，指出miR-221是潛在的CRC診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

目前PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于CRC外周血腫瘤相關(guān)基因片段的定量檢測和比較，其中RT-PCR成為最常用的一種檢測技術(shù)。除此之外，有研究顯示，與PCR相比，BEAMing(Beads Emulsion Amplification Magnetics)的流式磁珠檢測技術(shù)能在血漿中檢測出更微量的基因片段［13］。

循環(huán)核酸作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物存在以下問題：

⑴尚未有成熟的技術(shù)用于外周血循環(huán)核酸的研究及臨床檢測。

⑵雖然血清和血漿中都能檢測到腫瘤相關(guān)核酸, 但兩者的結(jié)果并不相同。

3 外周血炎癥反應(yīng)

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移力取決于腫瘤細(xì)胞自身以及機(jī)體環(huán)境兩個(gè)方面。腫瘤的異常表型可以刺激炎癥淋巴細(xì)胞在腫瘤組織周圍浸潤。此外，由腫瘤的生理作用導(dǎo)致的組織破壞和降解可能引起普遍的非特異性的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和存活、引起氧化應(yīng)激、促進(jìn)血管生成，在腫瘤生長、擴(kuò)散及預(yù)后方面起著重要作用［14］。

系統(tǒng)炎癥反應(yīng)( systemic inflammatory response)是由腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生的包括IL-1β、IL-6和TNF-α在內(nèi)的前體炎癥細(xì)胞因子驅(qū)動的，同時(shí)伴隨局部的免疫反應(yīng)，在多種常見實(shí)體腫瘤進(jìn)展中起重要作用，并且在術(shù)前易評估，具有潛在的研究及應(yīng)用價(jià)值［15］。

3.1 炎癥相關(guān)因子

3.1.1 C-反應(yīng)蛋白( C-reactive protein，CRP)

前體炎癥細(xì)胞因子刺激急性期蛋白的釋放，最明顯的是CRP。血漿中升高的CRP與實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，并且可能是CRC預(yù)后的獨(dú)立因素［16］。有研究指出CRP可以結(jié)合到激活的Fc受體，激活PI3K/Akt、ERK和NF-kappaB通路，抑制由化療藥物引起的細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活等，在惡性腫瘤的進(jìn)展中起直接作用［17］。

3.1.2 血清白蛋白

血清白蛋白也是反映系統(tǒng)炎癥的急性期蛋白。目前認(rèn)為系統(tǒng)炎癥與血清白蛋白濃度的降低相關(guān)，血清白蛋白濃度的降低促進(jìn)了循環(huán)前體炎癥細(xì)胞因子水平的升高，尤其是IL-6。低白蛋白血癥與晚期惡性腫瘤患者不良預(yù)后相關(guān)。Neal等［18］的研究顯示，血清白蛋白是腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal liver metastases)術(shù)后不良預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子。

3.1.3 系統(tǒng)炎癥評分

基于血清CRP和白蛋白水平的改良格拉斯哥預(yù)后評分( modifi ed glasgow prognostic score，mGPS)是重要的評價(jià)機(jī)體系統(tǒng)炎癥的指標(biāo)。有研究顯示，在術(shù)前CEA水平正常的CRC患者中，mGPS可以輔助預(yù)測患者的術(shù)后生存［19］。Furukawa等［20］指出mGPS是預(yù)測伴有不可切除肝轉(zhuǎn)移的CRC總體生存的獨(dú)立因素，當(dāng)白蛋白＜3.5 g/dL、CRP＞1.0 mg/dL時(shí)，患者預(yù)后不良。Proctor等［21］的研究結(jié)果肯定了mGPS在惡性腫瘤預(yù)后中的作用，并且建議mGPS可應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但同時(shí)指出其預(yù)后作用與腫瘤部位無關(guān)。

3.2 細(xì)胞成分

3.2.1 中性粒細(xì)胞

在多種惡性腫瘤中，循環(huán)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)具有預(yù)后價(jià)值。

骨髓來源的細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞，通過提供合適的生長環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在促進(jìn)腫瘤侵襲表型中起了直接的作用。中性粒細(xì)胞是TGF-β等可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲配體的主要產(chǎn)生者。再者，中性粒細(xì)胞釋放的循環(huán)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)具有促進(jìn)腫瘤血管形成及腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，從而在腫瘤的發(fā)展過程中起重要作用。

3.2.2 中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的比值(neutrophil -to-lymphocyte ratio，NLR)

系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)也反映在外周循環(huán)白細(xì)胞相對水平的改變上。Walsh等［22］發(fā)現(xiàn)了NLR在CRC患者中的預(yù)后價(jià)值，分析了Dukes’A到Dukes’D期的CRC病例，得出術(shù)前NLR＞5的患者預(yù)后較差，并且NLR的平均比值伴隨疾病的分期增加而增大。最新的一篇文獻(xiàn)指出，NLR＞5可以預(yù)測CRC伴肝轉(zhuǎn)移患者在接受經(jīng)皮射頻消融治療后的不良預(yù)后［23］。

盡管目前有很多研究支持炎癥相關(guān)因素與CRC患者預(yù)后相關(guān)的觀點(diǎn)，但是其具體作用機(jī)制的研究仍在進(jìn)行。

Richards等［24］指出腫瘤壞死是啟動全身炎癥反應(yīng)的因素，其作用機(jī)制可以解釋為惡性腫瘤細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。炎癥和壞死共同為基因突變、表觀調(diào)控、細(xì)胞死亡和增殖提供環(huán)境。在慢性炎癥的部位，細(xì)胞壞死促進(jìn)局部上皮細(xì)胞的生長和增殖，并且通過內(nèi)源性的抑制因子阻斷與凋亡相關(guān)的重要通路，從而限制細(xì)胞凋亡的啟動。同時(shí)，釋放的壞死介質(zhì)進(jìn)一步激活炎癥通路，這些炎癥通路在腫瘤血管的形成、上皮細(xì)胞的增生和基質(zhì)的形成等方面十分重要，是腫瘤生長所必須的條件［25-26］。

系統(tǒng)炎癥在多個(gè)方面影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，由于其涉及范圍廣、機(jī)制復(fù)雜，目前對系統(tǒng)炎癥方面的研究大部分集中于臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，今后需要研究者對炎癥機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究，從而確定系統(tǒng)炎癥影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。

4 凝血相關(guān)指標(biāo)

惡性腫瘤患者的血液多呈高凝狀態(tài)，血漿纖維蛋白原水平、血小板水平等相比一般疾病顯著升高。

有研究顯示，CRC患者治療前的血小板水平與腫瘤相關(guān)的生存率有關(guān)，治療前血小板水平升高是CRC患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子［27］。腫瘤細(xì)胞與血小板的相互作用機(jī)制可以解釋為以下幾點(diǎn)：

⑴腫瘤細(xì)胞通過分泌IL-6等相關(guān)因子，刺激骨髓產(chǎn)生巨核細(xì)胞，從而導(dǎo)致血小板增多。

⑵腫瘤細(xì)胞通過分泌VEGF和表達(dá)多種膜表面受體來激活血小板、促進(jìn)血小板黏附于腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞。

⑶激活狀態(tài)的血小板產(chǎn)生多種微粒和血管生成因子，例如血小板來源生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)和VEGF，促進(jìn)腫瘤血管形成，增加腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖和趨化作用，從而加速腫瘤的生長、增強(qiáng)侵襲力［28］。

此外，凝血和纖維蛋白溶解的激活在腫瘤侵襲過程中起重要作用。D-二聚體是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子ⅩⅢ交聯(lián)后，再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，是一個(gè)特異性的纖溶過程標(biāo)記物，其水平的增高反映繼發(fā)纖溶活性的增強(qiáng)，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。

5 總結(jié)

本文從不同的角度論述了重要的預(yù)后相關(guān)因子，但是這些預(yù)后相關(guān)因子可能并非獨(dú)立作用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，它們在深層的作用機(jī)制上相互關(guān)聯(lián)和滲透。今后需要更多的前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)目前所得因子的預(yù)后價(jià)值，以及深入的基礎(chǔ)研究來確定預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞信號通路、基因的改變和腫瘤細(xì)胞生長的標(biāo)志物，從而為新的腫瘤治療策略提供理論依據(jù)，進(jìn)而改善CRC患者的生存。

［1］AGGARWAL C, MEROPOL N J, PUNT C J, et al.Relationship among circulating tumor cells, CEA and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer［J］.Ann Oncol, 2012.［Epub ahead of print］.

［2］HANAHAN D, WEINBERG R A.Hallmarks of cancer: the next generation［J］.Cell, 2011, 144(5): 646-674.

［3］RAHBARI N N, AIGNER M, THORLUND K, et al.Metaanalysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer［J］.Gastroenterology, 2010, 138(5): 1714-1726.

［4］LOWES L E, HEDLEY B D, KEENEY M, et al.User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the Cell Search(R) system［J］.Cytometry A, 2012, 81(11): 983-995.

［5］BONNOMET A, BRYSSE A, TACHSIDIS A, et al.Epithelialto-mesenchymal transitions and circulating tumor cells［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2010, 15(2): 261-273.

［6］BARBAZAN J, ALONSO-ALCONADA L, MUINELOROMAY L, et al.Molecular characterization of circulating tumor cells in human metastatic colorectal cancer［J］.PLoS One, 2012, 7(7): e40476.

［7］SCHELTER F, GRANDL M, SEUBERT B, et al.Tumor cellderived Timp-1 is necessary for maintaining metastasispromoting Met-signaling via inhibition of Adam-10［J］.Clin Exp Metastasis, 2011, 28(8): 793-802.

［8］SCHWARZENBACH H, HOON D S, PANTEL K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients［J］.Nat Rev Cancer, 2011, 11(6): 426-437.

［9］FERRONI P, ROSELLI M, SPILA A, et al.Serum sE-selectin levels and carcinoembryonic antigen mRNA-expressing cells in peripheral blood as prognostic factors in colorectal cancer patients［J］.Cancer, 2010, 116(12): 2913-2921.

［10］LIU Z P, LI L M, LIU X L, et al.Comparative analysis of tumor markers and evaluation of their predictive value in patients with colorectal cancer［J］.Onkologie, 2012, 35(3): 108-113.

［11］NG E K, CHONG W W, JIN H, et al.Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening［J］.Gut, 2009, 58(10): 1375-1381.

［12］PU X X, HUANG G L, GUO H Q, et al.Circulating miR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognostic marker of colorectal cancer and is correlated with p53 expression［J］.J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(10): 1674-1680.

［13］DIEHL F, SCHMIDT K, DURKEE K H, et al.Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients［J］.Gastroenterology, 2008, 135(2): 489-498.

［14］MANTOVANI A, ALLAVENA P, SICA A, et al.Cancerrelated inflammation［J］.Nature, 2008, 454(7203): 436-444.

［15］ROXBURGH C S, MCMILLAN D C.Role of systemic inflammatory response in predicting survival in patients with primary operable cancer［J］.Future Oncol, 2010, 6(1): 149-163.

［16］VAN DE POLL M C, KLAVER Y L, LEMMENS V E, et al.C-reactive protein concentration is associated with prognosis in patients suffering from peritoneal carcinomatosis of colorectal origin［J］.Int J Colorectal Dis, 2011, 26(8): 1067-1073.

［17］YANG J, WEZEMAN M, ZHANG X, et al.Human C-reactive protein binds activating Fcgamma receptors and protects myeloma tumor cells from apoptosis［J］.Cancer Cell, 2007, 12(3): 252-265.

［18］NEAL C P, MANN C D, SUTTON C D, et al.Evaluation of the prognostic value of systemic inflammation and socioeconomic deprivation in patients with resectable colorectal liver metastases［J］.Eur J Cancer, 2009, 45(1): 56-64.

［19］ISHIZUKA M, NAGATA H, TAKAGI K, et al.Inflammationbased prognostic system predicts postoperative survival of colorectal cancer patients with a normal preoperative serum level of carcinoembryonic antigen［J］.Ann Surg Oncol, 2012, 19(11): 3422-3431.

［20］FURUKAWA K, SHIBA H, HARUKI K, et al.The Glasgow prognostic score is valuable for colorectal cancer with both synchronous and metachronous unresectable liver metastases［J］.Oncol Lett, 2012, 4(2): 324-328.

［21］PROCTOR M J, MORRISON D S, TALWAR D, et al.A comparison of inflammation-based prognostic scores in patients with cancer.A Glasgow Inflammation Outcome Study［J］.Eur J Cancer, 2011, 47(17): 2633-2641.

［22］WALSH S R, COOK E J, GOULDER F, et al.Neutrophillymphocyte ratio as a prognostic factor in colorectal cancer［J］.J Surg Oncol, 2005, 91(3): 181-184.

［23］ZHANG Y, PENG Z, CHEN M, et al.Elevated neutrophil to lymphocyte ratio might predict poor prognosis for colorectal liver metastasis after percutaneous radiofrequency ablation［J］.Int J Hyperthermia, 2012, 28(2): 132-140.

［24］RICHARDS C H, ROXBURGH C S, ANDERSON J H, et al.Prognostic value of tumour necrosis and host inflammatory responses in colorectal cancer［J］.Br J Surg, 2012, 99(2): 287-294.

［25］VAKKILA J, LOTZE M T.Inflammation and necrosis promote tumour growth［J］.Nat Rev Immunol, 2004, 4(8): 641-648.

［26］COLOTTA F, ALLAVENA P, SICA A, et al.Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability［J］.Carcinogenesis, 2009, 30(7): 1073-1081.

［27］SASAKI K, KAWAI K, TSUNO N H, et al.Impact of preoperative thrombocytosis on the survival of patients with primary colorectal cancer［J］.World J Surg, 2012, 36(1): 192-200.

［28］JAIN S, HARRIS J, WARE J.Platelets: linking hemostasis and cancer［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(12): 2362-2367.