楊蕙王宇紅張秀麗韓遠山丁志平

［1.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥藥理（心血管）實驗室，湖南長沙410007；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410007；4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙，410007］

馬錢子粉屬于常用的有毒中藥，臨床主要用于治療各種難治性疾病，由于療效確切，力猛效捷，為歷代醫(yī)家所推崇。前期工作研究表明，馬錢子微粉化后由于比表面積增加，所含藥效成分的釋放速度與釋放量遠優(yōu)于中藥普通粉體與傳統(tǒng)中藥飲片及傳統(tǒng)中藥丸散劑，其藥效成分吸收率增加，生物利用度提高［1-2］。因此進一步明確馬錢子超微粉抗炎的量效關系對于馬錢子超微粉的臨床應用具有重要意義。馬錢子超微粉毒、效成分復雜，毒性機制不明確，隨著藥物劑量的遞增，機體將相繼出現(xiàn)治療效應、毒性效應，直至死亡效應。出現(xiàn)這3種效應的劑量分別稱為有效劑量（ED）、毒性劑量（TD）和致死劑量（LD）。筆者以類風濕性關節(jié)炎（RA）大鼠為模型動物，以最大效能（Emax）、效價強度（KD）、治療指數(shù)（TI）、安全界限（SF）為參數(shù)，考察微粉化對馬錢子療效與毒性量效關系的影響。

1 實驗材料

1.1 試劑與儀器馬錢子購自湖南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，經(jīng)鑒定為馬錢科植物云南馬錢Strychnos pierriana A.W.Hill的干燥成熟種子，其質(zhì)量符合2010年版《中國藥典》馬錢子項下規(guī)定。馬錢子超微粉與其粗粉均采用同一批原料制備而成，批號分別為W20090203、C20090203，臨用前以蒸餾水配成混懸液。弗氏完全佐劑由美國Sigma公司提供。YLS-7B型足趾容積測定儀（山東醫(yī)學科學院設備站）。

1.2 實驗動物SD大鼠，SPF級，180～200 g，200只，雄性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號NHASLKJ 20100778，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2009-0004。全價顆粒飼料由湖南中醫(yī)藥大學SPF實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)室溫：20～24℃，相對濕度：45%～60%。實驗動物環(huán)境設施合格證號：SYXK（湘）2009-0001。

2 實驗方法

2.1 馬錢子超微粉與其粗粉抑制RA大鼠足腫脹的量效關系試驗

2.1.1 分組與給藥SD雄性大鼠78只，適應性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機分為13組：空白組、模型組、陽性藥（雷公藤多苷片8.0 mg/kg）組、受試藥物（馬錢子超微粉與其粗粉各為50.0、35.0、24.5、17.2、12.0 mg/kg）組。所有動物于造模前測定左、右后部足趾容積，除空白對照組外，其余各組動物右后部足趾注射弗氏完全佐劑0.1 mL，復制類風濕性關節(jié)炎大鼠模型［3］。造模1 h后按10 mL/kg灌胃給藥，模型對照組與空白對照組給予等劑量的蒸餾水，每天給藥1次，連續(xù)給藥21 d。

2.1.2 觀測指標分別于造模24 h，6 d，12 d，15 d，21 d測量各組大鼠右后部足趾容積，于造模后12 d，15 d，21 d測量各組大鼠左后部足趾容積。

2.1.3 馬錢子超微粉與其粗粉抑制RA大鼠足腫脹的ED50、ED95以大鼠右后部足趾容積與左后部足趾容積計算足腫脹率、足腫脹抑制率及效應率，根據(jù)量效關系實驗結(jié)果 進行線性回歸，Bliss法計算馬錢子超微粉與其粗粉的ED50及ED95。足腫脹率（%）=（右后部足趾容積－左后部足趾容積）/左后部足趾容積×100%。足腫脹抑制率（%）=（模型組足腫脹率－給藥組足腫脹率）/模型組足腫脹率×100%。藥物效應率（%）=某劑量的抑制率/最大抑制率×100%。

2.2 急性致死量試驗

2.2.1 劑量確定經(jīng)預實驗得SD大鼠馬錢子超微粉最低全致死量Dm為207.4 mg/kg、最高不致死量Dn為83.3 mg/kg，馬錢子粗粉最低全致死量Dm為259.0 mg/kg、最高不致死量Dn為104.2 mg/kg。按組間等比關系，把馬錢子超微粉按1∶0.7961分為207.4、165.1、131.4、104.6及83.3 mg/kg 5個劑量組，粗粉按1∶0.7964分為259.0、206.3、164.3、130.8及104.2 mg/kg 5個劑量組。

2.2.2 分組及給藥SD雄性大鼠100只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量分層隨機分為10組，每組10只，馬錢子超微粉與其粗粉各5組，禁食12 h后一次性灌胃上述劑量的馬錢子超微粉或其粗粉，灌胃體積10 mL/kg，然后正常飼養(yǎng)并觀察14 d，記錄期間各組動物的死亡數(shù)。以Bliss法計算馬錢子超微粉與其粗粉的LD50及LD5。

2.3 安全范圍計算按照以下公式計算大鼠灌胃馬錢子超微粉與其粗粉的治療指數(shù)TI=LD50/ED50，安全界限SF=LD5/ED95。

3 結(jié)果

3.1 馬錢子超微粉與其粗粉抑制RA大鼠足腫脹的量效關系曲線

3.1.1 馬錢子超微粉與其粗粉抑制RA大鼠足腫脹的作用見表1。結(jié)果 示馬錢子超微粉與其粗粉均可明顯抑制弗氏完全佐劑導致的大鼠足腫脹。馬錢子超微粉在12.0～24.5 mg/kg范圍內(nèi)，量增效增；在35.5～50.0 mg/kg劑量范圍內(nèi)，量增效減。其粗粉在12.0～35.0 mg/kg劑量范圍內(nèi)，量增效增；50.0 mg/kg劑量，量增效減。相同劑量的馬錢子超微粉藥效明顯優(yōu)于其粗粉，且其最小有效劑量小于粗粉。在馬錢子超微粉24.5～50.0 mg/kg劑量范圍量增效減的原因，可能是給藥劑量超過了最大安全劑量，導致毒性反應，從而降低了其藥效。

表1 各組RA大鼠足腫脹情況比較（±s）

表1 各組RA大鼠足腫脹情況比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別抑制率（%）效應率（%）模型組--劑量（mg/kg）腫脹率（%）-58.2±13.5雷公藤多苷片32.696.4 n66 20.039.2±6.6馬錢子超微粉612.051.4±7.311.734.6馬錢子超微粉617.246.4±11.720.360.1馬錢子超微粉624.538.5±13.0*33.8100.0馬錢子超微粉635.041.1±5.7**29.487.0馬錢子超微粉650.050.3±12.313.640.2馬錢子粗粉612.062.3±12.8-7.0-24.6馬錢子粗粉617.258.6±11.6-0.7-2.5馬錢子粗粉624.547.3±10.918.765.6馬錢子粗粉635.041.6±17.628.5100.0馬錢子粗粉650.049.9±14.914.350.2

3.1.2 線性擬合［4-5］見圖1。在馬錢子超微粉及其粗粉的量增效增劑量范圍內(nèi)，采用線性擬合方法 分別分析其量效關系。結(jié)果 表明，馬錢子超微粉及粗粉的劑量與其效應率呈正比。

圖1 馬錢子超微粉及粗粉效應率的線性擬合曲線

圖2 馬錢子超微粉抑制RA大鼠足腫脹的量效曲線

3.1.3 多項式曲線擬合見圖2及圖3。在馬錢子超微粉及粗粉的全劑量范圍內(nèi)，采用多項式曲線擬合方法 ，分析其足腫脹抑制率的量效關系。

馬錢子超微粉與其粗粉足腫脹抑制率量效曲線擬合方程為：

超微粉：Y=-0.167X2+10.441X-66.082，R2=0.9418。當劑量為31.26 mg/kg時，其最大效能Emax=97.11%，效價KD=14.21 mg/kg，斜率為5.69。

粗粉：Y=-0.2194X2+15.911X-194.51，R2=0.9571。當劑量為36.26 mg/kg時，其最大效能Emax=93.96%，效價KD=21.63 mg/kg，斜率為6.42。

馬錢子超微粉的Emax較其粗粉大，提示，馬錢子超微粉抑制足腫脹的藥效優(yōu)于其粗粉；馬錢子超微粉的KD較其粗粉小，即馬錢子超微粉的效價強度增大，提示，馬錢子超微粉50%Emax所對應劑量較其粗粉?。蓽p少34.3%），馬錢子超微粉臨床使用劑量可以減低至其粗粉的2/3；斜率減小，表明馬錢子超微粉的有效劑量范圍增大了1.13倍。

圖3 馬錢子超微粉與其粗粉效應率擬合曲線

從圖3可知，馬錢子超微粉ED50=14.3（95%可信區(qū)間為13.4～15.1），ED5=8.5，ED95=24.1；其粗粉ED50=23.2（95%可信區(qū)間為22.5～23.9），ED5=18.8，ED95=28.6。

3.2 馬錢子超微粉與其粗粉的LD50見圖4。灌胃馬錢子超微粉或其粗粉后，一般大鼠會在約10～20 min出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為全身抽搐、或全身僵直，進而出現(xiàn)呼吸停止而死亡，若出現(xiàn)中毒癥狀后能恢復正常者，則30 min后基本不再復發(fā)，并恢復正常活動及飲食。

馬錢子超微粉LD50=131.4（95%可信區(qū)間為117.01～147.6），LD5=91.6；馬錢子粗粉LD50=156.8（95%可信區(qū)間為139.69～175.7），LD5=110.4。馬錢子超微粉SD大鼠的急性毒性大于其粗粉。

3.3 馬錢子超微粉與其粗粉的TI、SF馬錢子超微粉與其粗粉急性灌胃給藥一次，分別計算得超微粉TI=131.4/14.3=9.2，超微粉SF=91.6/24.1=3.8；粗粉TI=156.8/23.2=6.8，粗粉SF=110.4/28.6=3.9。

結(jié)果 提示，馬錢子超微粉的治療指數(shù)較其粗粉升高，則表明采用小劑量多次給藥形式，馬錢子超微粉較其粗粉相對安全；馬錢子超微粉與其粗粉的安全界限基本相當，則表明馬錢子超微粉與其粗粉一次給藥的安全性無明顯差異。

圖4 馬錢子超微粉與其粗粉死亡率擬合曲線

4 討論

馬錢子超微粉的ED50、ED95分別為14.3、24.1 mg/kg，LD50、LD5分別為131.4、91.6 mg/kg；馬錢子粗粉的ED50、ED95分別為23.2、28.6 mg/kg，LD50、LD5分別為156.8、110.4 mg/kg。結(jié)果 表明，馬錢子超微粉與其粗粉的治療劑量與中毒劑量較為接近，安全范圍較窄。馬錢子超微粉50%Emax所需劑量較其粗粉小（約0.66倍），其臨床使用劑量可以減低至其粗粉的2/3；微粉化使馬錢子的有效劑量范圍增大了1.13倍。

治療指數(shù)（TI）是衡量藥物安全性的一個指標，以LD50與ED50之比來表示。TI越大，相對越安全，一般TI＞3較安全而TI＜2不安全。安全界限（SF）是定量比較一次給藥的安全性，以單次給藥后的LD5與ED95之比來表示，克服了TI不能反映療效和毒性的劑量-效應關系的缺點。馬錢子超微粉的治療指數(shù)TI=9.2、安全界限SF=3.8，其粗粉的治療指數(shù)TI=6.8、安全界限SF=3.9。結(jié)果 提示，馬錢子超微粉與其粗粉小劑量多次給藥相對較安全，且馬錢子超微粉小劑量給藥較其粗粉相對安全。馬錢子超微粉與其粗粉的安全界限接近，馬錢子超微粉與其粗粉一次給藥的安全性基本相當。

《中國藥典》收載的馬錢子粉（細粉），由于其安全劑量范圍較窄，臨床應用受到限制。本試驗結(jié)果 表明，馬錢子微粉化后最小有效劑量降低、安全劑量范圍增大，臨床可用于治療類風濕關節(jié)炎等疾病，但仍需要調(diào)整劑量，確保安全有效。

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