張鐵華張永利張春麗劉林英楊濤

（1.河北省玉田縣醫(yī)院，河北玉田064100；2.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北唐山063000）

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是多因素綜合作用的結(jié)果 ，主要包括氧自由基的損傷作用，細(xì)胞內(nèi)的鈣超載現(xiàn)象，白細(xì)胞作用以及細(xì)胞凋亡等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，丹參對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀(guān)察應(yīng)用丹參注射液后，對(duì)兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響，進(jìn)一步證實(shí)丹參注射液對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只健康純種大耳白兔，購(gòu)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量（3.0±0.2）kg，雄性，外眼及眼底檢查均正常，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）Hplas-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像工程公司）丹參注射液（四川三精升和制藥有限公司10 mL/支），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SABC試劑盒（即用型，武漢博士德生物工程有限公司），Caspase-3免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 分組與給藥隨機(jī)分為對(duì)照組與治療組，以20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，同時(shí)兔眼滴用0.4%倍諾喜（奧布卡因）行表面麻醉，對(duì)照組球后注射平衡鹽溶液0.05 mL（48只，左眼），治療組球后注射丹參注射液0.05 mL（48只，右眼）。

1.4 模型制備給藥30min后開(kāi)始建立模型，復(fù)方托品酰胺滴眼液散瞳后將連接生理鹽水的5號(hào)頭皮針從耳前方角鞏膜緣內(nèi)刺入前房，緩慢升高輸液瓶高度產(chǎn)生16.7kPa壓力，觀(guān)察并監(jiān)測(cè)眼睛情況。60min后將輸液瓶高度逐漸降低，緩慢減低眼內(nèi)壓，直至輸液瓶高度到動(dòng)物眼球水平，拔除灌注針頭，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)根據(jù)各組不同的再灌注時(shí)間，分別于損傷后1、6、24和72 h全身麻醉后，耳緣靜脈快速注入空氣栓塞處死，取出眼球，至于冰生理鹽水中，剪開(kāi)角鞏膜緣，棄去眼前節(jié)及玻璃體，外翻眼球壁，在顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，分析天平稱(chēng)重，用生理鹽水稀釋?zhuān)瑒驖{，低溫離心機(jī)3500 r/min離心10 min，取上清液，置于4%多聚甲醛固定24 h，然后小心去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，將后段眼環(huán)再固定4 h。流動(dòng)自來(lái)水沖洗24 h，之后于75%酒精（60 min）→85%酒精（60 min）→95%酒精（60 min）→95%酒精（60 min）→無(wú)水酒精Ⅰ（60 min）→無(wú)水酒精Ⅱ（40 min）→二甲苯Ⅰ（15 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→將眼球壁自視乳頭處縱向切開(kāi)，距角鞏膜緣0.2 mm向鼻側(cè)和顳側(cè)各取1 cm×0.5 cm的視網(wǎng)膜組織，將視網(wǎng)膜組織分別置于68℃恒溫箱浸蠟（2 h），石蠟包埋。行前后方向視網(wǎng)膜全層切片，片厚2.5 μm。切片分采用TUNEL（即脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）染色計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞及計(jì)數(shù)Caspase-3的蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5.1 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)每只眼球取兩張切片進(jìn)行分析，用圖像分析計(jì)數(shù)系統(tǒng)對(duì)凋亡神經(jīng)節(jié)細(xì)胞切片進(jìn)行圖像分析。在圖像分析儀上對(duì)待測(cè)樣本取樣，在視網(wǎng)膜切片中央部位向兩側(cè)各取兩個(gè)連續(xù)不重疊的高倍視野（HP），分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，4者相加的結(jié)果 作為每mm2的平均TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 免疫組化檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，細(xì)胞漿染成棕黃色為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。在視網(wǎng)膜切片中央部位向兩側(cè)各取兩個(gè)連續(xù)不重疊的高倍視野（HP），計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，算出平均數(shù)即為每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)，方差分析同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參注射液對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)表1。除1 h外，同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 丹參注射液Caspase-3的蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)表2。除1h外，同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與治療組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，如視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈栓塞、缺血性視神經(jīng)病變、青光眼等在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，RIR是通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞凋亡引起神經(jīng)元死亡所致，最終的結(jié)局均是RGC的凋亡［1］。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，凋亡是RIRI后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的形式之一［2］。凌士奇等［3］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RIR中視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞存在著明顯的凋亡征象，尤以RIRI 24 h組最為顯著。凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)遵循其規(guī)律，張瑞等［4］通過(guò)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中缺血再灌注視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)再灌注24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見(jiàn)凋亡小體。李國(guó)棟等［5］應(yīng)用TUNEL的方法 ，研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性。Kaneda［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凋亡最早出現(xiàn)在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后6 h，24 h凋亡細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到高峰，48 h開(kāi)始下降，168 h凋亡細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)極少，而在正常視網(wǎng)膜幾乎未見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。筆者應(yīng)用TUNEL方法 進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)：正常兔視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 也證實(shí)了上述觀(guān)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為：在缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)生了細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，最早出現(xiàn)在再灌注后1 h，6 h后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，24 h細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)到了高峰，并在外核層偶爾可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，到了再灌注后72 h，仍然有凋亡細(xì)胞，說(shuō)明了再灌注后72 h，視網(wǎng)膜的損傷尚未完全修復(fù)，與Ettaiche等［7］的研究結(jié)果 相近。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族（caspases）是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后實(shí)施是通過(guò)caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的。Caspases的激活表現(xiàn)為“瀑布式”的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而caspase-3是caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種程序啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐的作用［8］。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶，直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體，酶解細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，切斷凋亡細(xì)胞與周?chē)?xì)胞的聯(lián)系，關(guān)閉DNA的復(fù)制與修復(fù)，降解DNA，最后將細(xì)胞解體并包裹形成凋亡小體［9］。caspase-3（cpp32）處于被認(rèn)為是蛋白級(jí)聯(lián)切割過(guò)程的凋亡核心位置，起著很重要的作用，稱(chēng)為死亡蛋白酶［10］。本研究發(fā)現(xiàn)caspase-3在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中表達(dá)明顯增多，進(jìn)一步證實(shí)此過(guò)程中細(xì)胞凋亡的存在，而治療組中，caspase-3表達(dá)明顯減弱。由上可以看出，丹參注射液能夠抑制caspase-3表達(dá)，并進(jìn)而抑制不同因素誘導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，從本實(shí)驗(yàn)中可以得出，丹參注射液在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中通過(guò)抑制caspase-3的表達(dá)而達(dá)到抑制凋亡的目的 。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用球后注射丹參注射液治療兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，觀(guān)察其對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡、caspase-3蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果 顯示：除1h外，治療組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)量、caspase-3蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。從本實(shí)驗(yàn)中可以得出：丹參注射液可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、抑制caspase-3表達(dá)和活化而起到對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)與治療作用。

表1 兩組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)／mm2，±s）

表1 兩組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)／mm2，±s）

與對(duì)照組同一時(shí)間比較，*P＜0.05。下同

組別再灌注24 h再灌注72 h治療組11.55±0.24*5.39±0.26*對(duì)照組18.56±0.277.00±0.21再灌注1 h再灌注6 h 1.10±0.116.58±0.27*1.16±0.1310.31±0.22 n 12 12

表2 兩組視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段Caspase-3表達(dá)比較（細(xì)胞數(shù)/mm2，±s）

表2 兩組視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段Caspase-3表達(dá)比較（細(xì)胞數(shù)/mm2，±s）

組別再灌注24 h再灌注72 h治療組8.25±0.15*5.23±0.26*對(duì)照組14.19±0.216.72±0.23 n 12 12再灌注1 h再灌注6 h 1.12±0.135.52±0.14*1.15±0.158.32±0.16

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