馬 亮，殷獎(jiǎng)悠，湛玉良

（中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029）

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，對(duì)白血病分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）中存在多種不同的基因突變和基因表達(dá)的改變，目前對(duì)核仁磷酸蛋白基因1（nucleophosmin family，member 1，NPM1）研究較多，該基因突變與患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后有很大的相關(guān)性，現(xiàn)作一綜述。

1 NPM的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能

核磷素（nucleophosmin，NPM），也稱為核仁磷酸蛋白B23或核仁間質(zhì)蛋白，包括NPM1、NPM2及NPM3 3種亞型。NPM1是位于核仁顆粒區(qū)的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核質(zhì)和胞質(zhì)之間，參與核糖體前體運(yùn)輸和合成及中心體的復(fù)制，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的周期進(jìn)程和增殖發(fā)育[1]。人類NPM1基因位于染色體5q35，基因全長(zhǎng)約23kb，含有12個(gè)外顯子，編碼由294個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。在分子結(jié)構(gòu)上NPM可分為3個(gè)區(qū)域，分別負(fù)責(zé)不同的功能[2]，由N端開始，NPM蛋白包含一個(gè)疏水區(qū)，它參與寡聚化過(guò)程，并與NPM分子伴侶活性相關(guān)。隨后2個(gè)富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性區(qū)，是與組蛋白結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。在兩個(gè)酸性區(qū)是核糖核酸酶活性區(qū)，與C端的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起構(gòu)成核糖核酸酶活性結(jié)構(gòu)域。NPM主要定位在核仁顆粒區(qū)，可通過(guò)核仁定位信號(hào)在核仁、胞核和胞質(zhì)之間往返，參與核質(zhì)間物質(zhì)的運(yùn)輸。

NPM具有多種生物學(xué)功能。一方面，NPM在rRNA前體加工過(guò)程中發(fā)揮核糖核酸內(nèi)切酶的活性，參與28S rRNA的形成，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的形成，同時(shí)NPM可作為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2（CDK2）/細(xì)胞周期蛋白E復(fù)合物的直接底物，被CDK2/cyclin E磷酸化，并從中心體中解離出來(lái)，啟動(dòng)中心體復(fù)制，在調(diào)控周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。另一方面，NPM可以與HIV-Rev等帶有核定位信號(hào)的蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)它們運(yùn)輸至核仁并阻止核仁內(nèi)多種蛋白質(zhì)的聚集，還可以結(jié)合組蛋白，介導(dǎo)核小體的合成和致密染色質(zhì)的舒展，發(fā)揮分子伴侶功能[3]。

2 NPM1突變發(fā)現(xiàn)及突變類型

Falini等[4]首先通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)591例AML患者NPM基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，其中208例患者 （占35.2%）白血病細(xì)胞胞漿中檢出NPM蛋白，NPM基因突變導(dǎo)致大量的NPM分子從核仁移位至胞漿，因此把基因突變致NPM胞漿移位的白血病細(xì)胞稱之為NPMc+細(xì)胞。這種 NPMc+細(xì)胞分布在除 M3、M4EO、M7以外的其它 AML FAB各亞型中，但在不同F(xiàn)AB亞型中突變率不同，如M2中約為20%，M4中為40%～50%，M5a中為40%～50%，M5b中則高達(dá)90%?？梢?，其與單核細(xì)胞關(guān)系較為密切[5]。經(jīng)測(cè)序證實(shí)為NPM1基因第12外顯子突變導(dǎo)致NPM蛋白核定位改變。

NPM突變的類型：NPM突變基因是雜合型的，在基因座上保留了1個(gè)野生型的等位基因。目前發(fā)現(xiàn)有多種NPM1基因突變，都是由在外顯子12的不同位置插入不同的核苷酸而產(chǎn)生，主要以6種變異體（mutation A-F）為主，其中最常見的是mutation A，它是在野生型NPM核苷酸序列第956-959位上插入1個(gè)TCTG 4個(gè)核苷酸而形成串聯(lián)重復(fù)序列；mutation B、C、D是在野生型NPM核苷酸序列上第960位之前插入4個(gè)不同堿基而產(chǎn)生；而mutation E、F是由于缺失了野生型NPM核苷酸序列第965-969位上的GGAGG堿基序列，但隨后插入了2種不同的9個(gè)堿基的序列而產(chǎn)生[6]。 Mutation A-F導(dǎo)致NPM1基因外顯子12的移碼突變，使NPM蛋白C末端的7種氨基酸色（W）-谷（Q）-W-精（R）-賴（K）-絲（S）-亮（L）被 11 個(gè)短肽鏈X-X-X-X-X-X-纈 （V）-S-L-R-K或13個(gè)短肽鏈 W-Q-天冬（D）-苯丙（F）-L-門冬（N）-R-L-F-K-K-異亮（I）-V所代替，從而導(dǎo)致NPM蛋白C端的288和290位點(diǎn)上至少有1個(gè)色氨酸發(fā)生突變而產(chǎn)生一個(gè)核輸出信號(hào)（NES），最終使NPM移位到胞漿。

Nakagawa等[7]進(jìn)一步研究提出，在野生型NPM分子結(jié)構(gòu)中C端的色氨酸只對(duì)NPM的核仁定位起主要作用，而對(duì)NPM的胞漿移位不起主要作用；他同時(shí)還提出在突變NPM的C端中存在一種核輸出信號(hào)序列（NES），由疏水性氨基酸殘基所組成。NES中的分子被輸出信號(hào)受體CRM1所識(shí)別，從而產(chǎn)生核輸出信號(hào)，導(dǎo)致NPM移位到胞漿。在野生型NPM的N端92-104位點(diǎn)有一個(gè)生理性的NES序列，若將此NES序列敲除或?qū)端突變產(chǎn)生的NES序列敲除，然后將NES序列敲除的NPM基因轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)無(wú)論敲除N端還是C端的任意一種NES序列，NPM都只能出現(xiàn)在核質(zhì)而不能聚集在胞漿中，這說(shuō)明突變NPM只有在同時(shí)具有兩種NES序列的情況下才能實(shí)現(xiàn)其胞漿的聚集。

3 NPM1突變檢測(cè)

關(guān)于NPM1突變的檢測(cè)，目前應(yīng)用的主要方法有PCR-毛細(xì)管電泳、變性高效液相色譜（DHPLC）、直接測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）以及免疫組化檢測(cè)胞漿中NPM蛋白等方法[9，12]，這幾種檢測(cè)方法各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。近年來(lái)DHPLC、毛細(xì)管電泳和RQ-PCR作為檢測(cè)基因突變方法，以其靈敏度高、自動(dòng)化、快速高效、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)漸漸成為各種基因突變檢測(cè)方法中常用的可靠方法。直接測(cè)序作為檢測(cè)基因突變的“金指標(biāo)”，隨著靈敏度不斷提高、檢測(cè)的成本進(jìn)一步降低，該方法也逐漸普及。

DHPLC：是在PCR產(chǎn)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。NPM1基因突變?yōu)殡s合子，PCR擴(kuò)增的基因不僅包括突變基因，還包括未突變等位基因。如果正?；蚝屯蛔兓蛟谠嚬軆?nèi)變性雜交，DHPLC的圖譜上會(huì)出現(xiàn)有別于正?；虻臉?gòu)象，出現(xiàn)不同的峰型，由此可以辨別是否有突變。Roti等[8]認(rèn)為該方法檢測(cè)突變高度敏感、可靠，并且只需對(duì)PCR產(chǎn)物直接檢測(cè)，因而快速廉價(jià)。但鄒積艷等[9]發(fā)現(xiàn)，DHPLC檢測(cè)結(jié)果受較多因素影響，雖然多次更換條件，部分突變患者的峰型并不典型，最終的判斷很容易出現(xiàn)假陰性。

毛細(xì)管電泳：是在基因序列分析儀上做毛細(xì)管電泳檢測(cè)來(lái)分析PCR基因產(chǎn)物[10]。毛細(xì)管電泳法是用熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物，觀測(cè)PCR獲得的基因片段在毛細(xì)管電泳圖上顯示的長(zhǎng)度，還可根據(jù)峰面積定量檢測(cè)突變型與野生型的比率。并且需要的樣本量很小，可對(duì)多重PCR產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)而不影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是，毛細(xì)管電泳要求擴(kuò)增產(chǎn)物不能太長(zhǎng)（一般＜500bp），否則會(huì)影響其準(zhǔn)確性，另外該方法需要價(jià)格昂貴的基因序列測(cè)定儀。作為一種快速的定性檢測(cè)方法，毛細(xì)管電泳具有很大的優(yōu)勢(shì)。

Q-PCR：可以精確地做基因定量，從而估計(jì)突變細(xì)胞在患者體內(nèi)的數(shù)量。Q-PCR基因定量往往用于檢測(cè)治療后的白血病微小殘留?。∕RD）。臨床治療要求檢測(cè)MRD的靈敏度達(dá)到惡性細(xì)胞占1/105～1/106個(gè)細(xì)胞的水平，并且要求快速、價(jià)廉、易于標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制，在不同實(shí)驗(yàn)室可以重復(fù)。Q-PCR完全可以達(dá)到要求，使臨床工作中對(duì)患者不同病期、不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果有了可比性[12]。Q-PCR有多種模式：Taqman探針?lè)?、熒光染料法、分子信?biāo)法等，但Q-PCR只能針對(duì)NPM1已知基因突變類型檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序：是檢測(cè)基因突變的“金指標(biāo)”。其往往受到基因組DNA同時(shí)存在正常（野生型）等位基因和突變等位基因片段混雜在一起的影響，需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，步驟較繁瑣，而且突變基因含量較低時(shí)，直接測(cè)序往往很難檢測(cè)到突變，靈敏度相對(duì)較低。

免疫組化：該方法簡(jiǎn)便易行，可同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)及分布，適用于標(biāo)本取材較少或髓外組織活檢等情況。有3種抗體可用于NPM的免疫組化檢測(cè)[13]。一種為標(biāo)記NPM的單克隆抗體，但其不能區(qū)分NPM突變型與野生型，只能通過(guò)其細(xì)胞定位（野生型位于細(xì)胞核，突變型位于胞漿）區(qū)分。此種抗體目前應(yīng)用最廣泛。另一種為多克隆抗體，可識(shí)別NPM突變型，但其診斷敏感性僅為50%～60%，因其高度特異性而主要應(yīng)用于NPMc+AML細(xì)胞系研究。第3種單克隆抗體只識(shí)別野生型NPM，此種單克隆抗體診斷意義不大。Falini等[13]分析200例NPM1基因突變患者，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)NPMc+，其中195例呈強(qiáng)陽(yáng)性，5例呈弱陽(yáng)性。對(duì)照250例野生型NPM1均為陰性。其缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確定量，對(duì)NPM1陰性檢測(cè)缺乏準(zhǔn)確性。

另外，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳也是檢測(cè)NPM1突變的一個(gè)比較好的方法，在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑如尿素等，可去除單鏈DNA的構(gòu)象變化，使電泳的單鏈遷移率只由DNA的長(zhǎng)度決定，從而可以分辨不同DNA標(biāo)本間的細(xì)微堿基數(shù)量差別。

4 NPM1檢測(cè)的臨床意義

Thiede等[14]進(jìn)行的大規(guī)模臨床研究結(jié)果顯示，在1485例AML患者中有408例（27.5%）存在4個(gè)核苷酸插入的NPM1突變，并且發(fā)現(xiàn)了13種新突變。核型正常者NPM1突變發(fā)生率（45.7%）明顯比核型異常者（8.5%）高，且表現(xiàn)為骨髓中原始細(xì)胞比例高、高白細(xì)胞和血小板，髓外浸潤(rùn)易見。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成人女性AML患者，NPM1突變發(fā)生率比男性患者要高1.5倍，提示存在性別差異。在兒童AML患者中，NPM1的發(fā)生率為2.1%～6.5%，在兒童AML-NK 患者發(fā)生率為 9%～26.9%[15，16]，而在成人 AML 患者中為25%～35%，在成人AML-NK患者中則高達(dá)45.7%～63.8%[17]，表明在兒童AML中NPM發(fā)生突變的可能性比成年病例要低得多。值得注意的是，兒童AML患者往往出現(xiàn)NPM-mtA以外的突變型，他們?cè)谛詣e和白細(xì)胞計(jì)數(shù)方面與NPM-wt患者沒有顯著的差異。

NPM1突變?cè)诼粤＜?xì)胞白血病患者中并不常見。Caudil等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在CML患者中一旦出現(xiàn)了NPM1突變，提示CML極有可能短期內(nèi)迅速發(fā)展為AML，患者預(yù)后較差。Zhang等[19]在38例原發(fā)性骨髓增生異常綜合征患者中，發(fā)現(xiàn)2例NPM1突變，分別是難治性貧血（RA）和難治性貧血伴原始細(xì)胞增多。這2例患者雖表現(xiàn)異常核型，但均未涉及NPM1所在的5號(hào)染色體的改變。

關(guān)于在中國(guó)AML人群中NPM1的發(fā)病率，2個(gè)研究發(fā)現(xiàn)[20，21]，中國(guó) AML患者 NPM1突變率分別為 16.4%與28.2%，前者應(yīng)用Q-PCR的方法，主要檢測(cè)的是NPM1A、B、D型突變，而后者采用的是毛細(xì)管電泳的方法，篩查NPM1所有類型突變。相對(duì)于國(guó)外研究，NPM1在中國(guó)AML患者發(fā)生率明顯低于國(guó)外。

Schnittger等[22]提出，可以把 NPMc+作為 AML預(yù)后良好的因素之一。然而，NPM1突變近40%的AML患者同時(shí)存在NPM1和FLT3-ITD基因突變，而在藥物誘導(dǎo)AML緩解的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD突變能降低完全緩解率，因此單純NPMc+的AML患者預(yù)后較好，若同時(shí)伴隨FLT3-ITD突變，將會(huì)影響AML患者對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的緩解效果[23]。Koh等[24]認(rèn)為，F(xiàn)LT3-ITD陰性、預(yù)后良好的NPM1突變是在956-959位點(diǎn)具有經(jīng)典TCTG插入的A型，其他非A型突變患者的中位生存期和總生存期較A型突變患者短。

另外，研究發(fā)現(xiàn)NPM1突變可以作為監(jiān)測(cè)MRD的新指標(biāo)。利用Q-PCR檢測(cè)突變NPM基因cDNA拷貝數(shù)，從而監(jiān)測(cè)MRD。在13例NPM1突變的AML患者中，突變NPM1基因cDNA拷貝數(shù)均＞30000。藥物治療后，其中10例獲得明顯緩解，其突變NPM1基因cDNA的拷貝數(shù)明顯下降，而藥物治療無(wú)效的3例患者其突變NPM基因cDNA拷貝數(shù)下降程度很小或不下降。這表明突變NPM基因cDNA拷貝數(shù)與患者的臨床狀況明顯相關(guān)[7]。NPM1基因突變穩(wěn)定，對(duì)2組AML復(fù)發(fā)者的研究發(fā)現(xiàn)，17例患者中的15例和15例患者中的10例NPM1基因突變持續(xù)存在[25]。通過(guò)定量PCR檢測(cè)NPM1基因突變，顯示其穩(wěn)定性與疾病臨床進(jìn)程密切相關(guān)[26]。因此，NPM1基因檢測(cè)可用于治療后監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)及微小殘留病變檢測(cè)。

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