李成學(xué)，趙 欣，錢 景，嚴(yán) 杰

整合素和鈣通道在人與小鼠鉤端螺旋體主要宿主細(xì)胞上分布的差異

李成學(xué)，趙 欣，錢 景，嚴(yán) 杰

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物系，浙江杭州310058)

目的：了解人和小鼠鉤端螺旋體(簡稱鉤體)主要宿主細(xì)胞上整合素與鈣通道表達(dá)情況及其差異。方法：采用免疫熒光和Western blot法，檢測人單核細(xì)胞株THP-1、小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞株J774A.1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC、小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株EOMA、人肝細(xì)胞株L-02、小鼠肝細(xì)胞株Hepa1-6、人腎小管上皮細(xì)胞株HEK-293、小鼠腎小球系膜上皮細(xì)胞株SV40-MES13、小鼠腎成纖維細(xì)胞株 NIH/3T3、人及小鼠血小板的 β1、β2、β3 類整合素分子以及 Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.3 電壓門控型鈣通道蛋白和 P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7受體門控型鈣通道蛋白的分布差異。結(jié)果：整合素 β1分子表達(dá)于 J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、L-02、Hepa1-6、HEK-239細(xì)胞以及人和小鼠血小板膜表面，β2分子表達(dá)于 J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA和NIH-3T3 細(xì)胞膜表面，β3 分子表達(dá)于 J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、Hepa1-6、HEK-239、NIH-3T3細(xì)胞以及人和小鼠血小板膜表面。ATP依賴性受體門控型鈣通道蛋白P2X1表達(dá)于人和小鼠血小板膜表面，P2X5表達(dá)于 J774A.1、THP-1、L-02、Hepa1-6、HEK-239 和 HUVEC 細(xì)胞膜表面，但未檢測出上述細(xì)胞或血小板表達(dá)其它鈣通道蛋白。結(jié)論：不同種類整合素分子和鈣通道蛋白在鉤體主要宿主細(xì)胞上表達(dá)明顯不同，這可能與鉤體對不同組織細(xì)胞致病性差異有關(guān)。

鉤端螺旋體，問號;整合素類/分析;鈣通道/分析;內(nèi)皮細(xì)胞/代謝;鉤端螺旋體;宿主細(xì)胞;整合素;表達(dá)

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(4):410-417.］

由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患自然疫源性傳染病，我國不少地區(qū)也是鉤體病流行疫區(qū)［1-2］。鼠類是鉤體主要宿主動物，感染后一般表現(xiàn)為隱性感染并持續(xù)尿液排菌，污染土壤和水源形成疫源地［3］。人感染鉤體后均發(fā)病且不同器官或組織病變有明顯差異，如肝細(xì)胞性黃疸、肺彌漫性出血、腎功能衰竭等［2-4］。Patti等首先提出細(xì)菌黏附素結(jié)合宿主細(xì)胞胞外基質(zhì)(ECM)分子的黏附模式［5］。近年發(fā)現(xiàn)鉤體可與宿主細(xì)胞纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、膠原蛋白(COL)、核心蛋白多糖(DEN)等ECM分子結(jié)合而黏附于細(xì)胞［6-9］。結(jié)合病原體黏附分子的ECM分子可激活整合素家族蛋白，啟動相關(guān)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)［10-12］。Ca2+是細(xì)胞第二信使。研究發(fā)現(xiàn)，鉤體感染的宿主細(xì)胞胞內(nèi)游離 Ca2+水平顯著升高［13-14］，胞內(nèi)游離Ca2+水平中度升高以及整合素激活可引起細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致病原體以吞噬或內(nèi)化方式進(jìn)入細(xì)胞，持續(xù)高水平Ca2+超載可激活細(xì)胞Ca2+依賴性蛋白酶和核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡［13-16］。由于不同物種或同一物種不同細(xì)胞表達(dá)的整合素及鈣通道類型可有差異，不同整合素及鈣通道對細(xì)胞吞噬病原體及生存狀態(tài)可有不同影響。本研究檢測了鉤體主要宿主細(xì)胞表達(dá)的整合素及鈣通道蛋白，以期為深入探討鉤體對不同宿主及細(xì)胞致病性差異及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株來源及培養(yǎng)基 人單核細(xì)胞株THP-1、小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞株J774A.1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC、人肝細(xì)胞株L-02、小鼠肝細(xì)胞株Hepa1-6、人腎小管上皮細(xì)胞株HEK-293、小鼠腎小球系膜上皮細(xì)胞株 SV40-MES13、小鼠腎成纖維細(xì)胞株NIH/3T3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株EOMA購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。J774A.1、THP-1、HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640(GiBco)，SV40-MES13、NIH/3T3、Hepa1-6、HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM(GiBco)。

1.1.2 主要試劑 整合素 β1和 β2亞基以及電壓門控型鈣通道蛋白 Cav3.1和 Cav3.3、Cav2.3抗體購自Abcam公司。整合素β3亞基以及電壓門控型鈣通道蛋白Cav3.2和受體門控型鈣通道蛋白 P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7購自Santa Crusz公司。各DyLightTM488標(biāo)記二抗購自Jackson ImmumoResearch公司。RIPA細(xì)胞裂解液購自Beyotime公司，細(xì)胞膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自KeyGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 血小板懸液制備 取20 ml自愿者及BALB/c小鼠外周血，用2%EDTA凝血。各抗凝血900 r/min離心10 min，棄血細(xì)胞沉淀。取上清加入2倍體積ACD液(0.82%枸櫞酸-2.21%枸櫞酸三納-2.65%葡萄糖溶液，pH 6.5)，混勻后900 r/min離心10 min，沉淀懸于5 ml ACD液中即為人及小鼠血小板懸液樣品。

1.2.2 細(xì)胞懸液制備 THP-1和 J774A.1為懸浮生長細(xì)胞，貼壁生長的 HUVEC、EOMA、L-02、Hepa1-6、HEK-293、SV40-MES13 和 NIH/3T3細(xì)胞用25 mmol/L EDTA室溫消化5 min。各細(xì)胞1 000 r/min 4℃離心10 min，細(xì)胞沉淀用Hanks液按洗滌并按上法離心，如此重復(fù)3次，取細(xì)胞沉淀再懸于Hanks液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至0.5 ～1 ×104/ml。

1.2.3 細(xì)胞膜蛋白制備 根據(jù)細(xì)胞膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明書，制備上述9種細(xì)胞(1×107)的膜蛋白樣品，采用紫外分光光度法測定各膜蛋白樣品中蛋白濃度［17］。

1.2.4 免疫熒光法檢測整合素 各細(xì)胞及各血小板懸液中分別加入整合素β1、β2和β3亞基抗體，37℃孵育 1 h，1 000 r/min離心 10 min。細(xì)胞沉淀用 Hanks液、血小板沉淀用ACD液重懸，1 000 r/min離心10 min，如此重復(fù)3次。細(xì)胞沉淀懸于Hanks液、血小板沉淀懸于ACD液中恢復(fù)至原體積，加入熒光標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h。按上法將細(xì)胞及血小板洗滌、離心3次后涂片，用熒光顯微鏡(HBO50/AC型，ZEISS)觀察。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不加一抗的陰性對照及不加任何抗體的空白對照。

1.2.5 Western blot法檢測鈣通道蛋白 3.5 ml血小板懸液900 r/min離心10 min，取血小板沉淀加入1 ml RIPA裂解液混勻，室溫作用5 min，13 000×g 4℃離心5 min，取上清用于鈣通道蛋白檢測。采用5%濃縮膠、10%分離膠的SDS-PAGE分離細(xì)胞膜蛋白樣品及血小板蛋白樣品，采用濕轉(zhuǎn)膜法(100 V、70 min)將聚丙烯酰胺凝膠中蛋白條帶轉(zhuǎn)移至FVDF(Milipore)膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)4℃封閉過夜。次日分別用各鈣通道蛋白抗體37℃孵育FVDF膜1 h，0.05%Tween-20-TBST 緩沖液漂洗 3次后加入熒光標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，0.05%Tween-20-TBST緩沖液漂洗3次后Odyssey熒光掃膜儀檢測雜交結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞整合素的表達(dá) 人或小鼠不同細(xì)胞表達(dá)的整合素種類有明顯差異(表1)。人單核細(xì)胞 THP-1和小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞J774A.1同時表達(dá) β1、β2和 β3 整合素，人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、小鼠血管內(nèi)皮EOMA、人腎小管上皮細(xì)胞HEK293均表達(dá)β1和β3整合素，人肝細(xì)胞L-02、人和鼠血小板僅表達(dá)β1整合素，小鼠肝細(xì)胞Hepa1-6、腎小球膜細(xì)胞SV40-MES13及腎成纖維細(xì)胞NIH/3T3均僅表達(dá)β3整合素(表1，圖1～3)。

表1 人和小鼠鉤體宿主細(xì)胞整合素表達(dá)譜Table 1 Expression spectrum of integrins on human and mouse host cells of Leptospira

2.2 不同細(xì)胞鈣通道蛋白的表達(dá) 所有受試的9種人和小鼠細(xì)胞及人和小鼠血小板均不表達(dá)電壓門控型鈣通道蛋白。人單核細(xì)胞THP-1、小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞J774A.1、人血管內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC、人肝細(xì)胞 L-02、小鼠肝細(xì)胞Hepa1-6和人腎小管上皮細(xì)胞HEK293表達(dá)受體門控型鈣通道蛋白P2X7，人和小鼠血小板表達(dá)受體門控型鈣通道蛋白P2X1，但小鼠血管內(nèi)皮EOMA、腎小球系膜細(xì)胞SV40-MES13和腎成纖維細(xì)胞NIH/3T3未檢出任何受體門控型鈣通道蛋白(表2和圖4)。

圖3 人和小鼠鉤體宿主細(xì)胞β3整合素表達(dá)狀況Fig.3 Expression ofβ3 integrin on human and mouse host cells of Leptospira

表2 人和小鼠鉤體宿主細(xì)胞鈣通道蛋白表達(dá)譜Table 2 Expression of calcium channel proteins on human and mouse host cells of Leptospira

圖4 人和小鼠鉤體宿主細(xì)胞鈣通道蛋白表達(dá)狀況Fig.4 Expression of calcium channel proteins on human and mouse host cells of Leptospira

3 討論

鼠類感染鉤體后，無明顯癥狀和體征，但可從尿液持續(xù)排出鉤體形成傳染源［3］。致病性鉤體有強(qiáng)大的侵襲力，從皮膚或黏膜途徑侵入人體后，迅速穿越血管壁引起鉤體血癥，隨血流播散至肺、肝、腎等內(nèi)臟器官，根據(jù)不同器官或組織損傷嚴(yán)重程度差異，臨床上將鉤體病至少分為5個型，如肺彌漫出血型、黃疸出血型、腎型等，病人恢復(fù)期也有短暫的尿液排菌［2，4］。單核-巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均能吞噬鉤體，但僅有單核-巨噬細(xì)胞能殺滅吞入的鉤體［18］。眾所周知，單核-巨噬細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞，啟動宿主抗感染免疫應(yīng)答。因此，本研究選擇人和小鼠單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用靶細(xì)胞。

整合素是各種哺乳類細(xì)胞廣泛表達(dá)的異二聚體跨膜蛋白，由α和β兩個亞基組成。α和β亞基分子均有一個較大的球形胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個較小的胞內(nèi)區(qū)，α和β亞基胞外區(qū)共同組成配體結(jié)合區(qū)，其配體主要為ECM分子、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和細(xì)胞間粘附分子-2(ICAM-2)。α亞基胞內(nèi)區(qū)功能尚不清楚，β亞基胞內(nèi)區(qū)具有調(diào)控細(xì)胞骨架重排及其相關(guān)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的功能序列，按β亞基的不同可將整合素分為 β1、β2和 β3亞家族［10-12］。不同配體分子與不同β亞基整合素相結(jié)合，激活胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路有所不同，細(xì)胞則表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為［19］。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞吞噬問號鉤體黃疸出血群賴型賴株后形成吞噬泡，吞噬泡與溶酶體融合后鉤體被殺滅，人單核細(xì)胞THP-1吞噬該鉤體后不形成吞噬泡，鉤體在THP-1細(xì)胞胞漿中繁殖［20］;鉤體感染導(dǎo)致人單核細(xì)胞、小鼠單核-巨噬細(xì)胞、人肺上皮細(xì)胞壞死或凋亡，但對人血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠腎成纖維細(xì)胞無任何影響［21］。本研究結(jié)果顯示，人單核細(xì)胞THP-1和小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞 J774A.1同時表達(dá) β1、β2和β3整合素，人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC表達(dá) β1和 β3整合素，小鼠腎成纖維細(xì)胞NIH/3T3僅表達(dá)β3整合素，提示上述細(xì)胞整合素表達(dá)譜不同可能與鉤體感染不同細(xì)胞的結(jié)局差異密切相關(guān)。

如前所述，胞內(nèi)游離Ca2+水平中度升高激發(fā)細(xì)胞吞噬病原體或病原體內(nèi)化，持續(xù)高水平Ca2+超載導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡［13-16］。胞內(nèi)游離Ca2+有兩個來源:經(jīng)膜鈣通道的Ca2+內(nèi)流以及胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體鈣庫的Ca2+釋放。根據(jù)工作機(jī)制不同，細(xì)胞膜鈣通道分為電壓門控型和受體門控型兩大類，前者主要分布于神經(jīng)、肌肉和內(nèi)分泌細(xì)胞，除P2X受體門控型鈣通道分布廣泛外，其余受體門控型鈣通道僅見于神經(jīng)系統(tǒng)［22-23］。以往研究中發(fā)現(xiàn)，問號鉤體黃疸出血群賴型賴株感染的單核-巨噬細(xì)胞和腎上皮細(xì)胞內(nèi)早期高水平游離Ca2+來源于Ca2+內(nèi)流，晚期高水平游離Ca2+為胞內(nèi)鈣庫動員所致，但相關(guān)鈣通道類型不明;鉤體感染的不同細(xì)胞其結(jié)局差異很大，人肺上皮細(xì)胞壞死，人單核細(xì)胞、小鼠單核-巨噬細(xì)胞及猴腎上皮細(xì)胞部分凋亡、部分壞死［13-14，21］。本研究結(jié)果顯示，人單核細(xì)胞THP-1、小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞J774A.1、人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人肝細(xì)胞L-02、小鼠肝細(xì)胞Hepa1-6和人腎小管上皮細(xì)胞HEK293均僅表達(dá)受體門控型鈣通道蛋白P2X7，提示該受體門控型鈣通道介導(dǎo)致了鉤體感染宿主細(xì)胞時Ca2+內(nèi)流，高水平胞內(nèi)游離Ca2+導(dǎo)致了感染細(xì)胞壞死或凋亡。

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Distribution diversity of integrins and calcium channels on major human and mouse host cells of Leptospira species

LI Cheng-xue，ZHAO Xin，QIAN Jing，YAN Jie
(Department of Medical Microbiology and Parasitology，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310058，China)

Objective:To determine the distribution of integrins and calcium channels on major human and mouse host cells of Leptospira species.Methods:The expression ofβ1，β2 and β3 integrins was detected with immuno fluorescence assay on the surface of human monocyte line THP-1，mouse mononuclear-macrophage-like cell line J774A.1，human vascular endothelial cell line HUVEC，mouse vascular endothelial cell EOMA，human hepatocyte line L-02，mouse hepatocyte line Hepa1-6，human renal tubular epithelial cell line HEK-293，mouse glomerular membrane epithelial cell line SV40-MES13，mouse collagenoblast line NIH/3T3，human and mouse platelets.The distribution of voltage gate control calcium channels Cav3.1，Cav3.2，Cav3.3 and Cav2.3，and receptor gate calcium channels P2X1，P2X2，P2X3，P2X4，P2X5，P2X6and P2X7were determined with Western blot assay.Results: β1 integrin proteins were positively expressed on the membrane surface of J774A.1，THP-1，HUVEC，EOMA，L-02，Hepa1-6 and HEK-239 cells as well as human and mouse platelets.β2 integrin proteins were expressed on the membrane surface of J774A.1，THP-1，HUVEC，EOMA，and NIH/3T3 cells.β3 integrin proteins were expressed on the membrane surface of J774A.1，THP-1，HUVEC，EOMA，Hepa1-6，HEK-239 and NIH/3T3 cells as well as human and mouse platelets.P2X1receptor gate calcium channel was expressed on the membrane surface of human and mouse platelets，while P2X5receptor gate calcium channel was expressed on the membrane surface of J774A.1，THP-1，L-02，Hepa1-6，HEK-239 and HUVEC cells.However，the other calcium channels were not detected on the tested cell lines or platelets.Conclusion:There is a large distribution diversity of integrins and calcium channel proteins on the major human and mouse host cells of Leptospira species，which may be associated with the differences of leptospire-induced injury in different host cells.

Leptospira interrogans;Integrins/anal;Calcium channels/anal;Endothelial cells/metab;Leptospira;Host cell;Integrin;Expression

R 377.5

A

1008-9292(2012)04-0410-08

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.04.009

2011-12-28

2012-04-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171534).

李成學(xué)(1982-)，男，碩士生，主要從事病原菌致病機(jī)制研究工作.

嚴(yán) 杰(1956-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事病原菌致病機(jī)制及基因工程疫苗的研究工作;E-mail:Med_bp@zju.edu.cn

［責(zé)任編輯 黃曉花］