吳 曦，劉鳳閣，楊建業(yè)，張自力，董軍立

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000)

傳統(tǒng)中醫(yī)針灸作為腰椎間盤突出癥(Lumber disc herniation，LDH)重要的治療手段之一，在臨床上使用廣泛，筆者于2011年12月至2012年2月通過(guò)針刺腰椎間盤突出癥大鼠模型夾脊穴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察針刺夾脊穴對(duì)腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤LI-1α、TNF-β濃度及MRI影像的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康3月齡雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，體重(200±20)g，來(lái)源于湖北十堰市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，來(lái)源號(hào)NO.00021069，按1～30編號(hào)后，使用隨機(jī)排列表法將大鼠隨機(jī)分為針刺干預(yù)組(A組)10只、對(duì)照組(B組)10只、正常組(C組)10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

常用注射器5號(hào)針頭(距針尖3 mm處有限位器)，常用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械，蘇州華佗牌一次性針灸針(直徑0.3 mm)，美國(guó) GE1.5TMRI成像系統(tǒng)，南京建成生物研究所LI-1α、TNF-β試劑盒(批號(hào)為：20111224、20111219)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模及干預(yù)

A組：禁食水1天，逐只行SPF級(jí)別手術(shù)。方法：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，麻醉滿意后俯仰臥位固定鼠板，腹部備皮，消毒，鋪巾。腹部正中切口(以髂嵴最高點(diǎn)為切口中點(diǎn)，長(zhǎng)1.5 cm)，分層切開腹壁，分離腹膜，用玻璃棒將腹腔腸管推至右側(cè)，可見腹主動(dòng)脈、后腔靜脈、髂腰動(dòng)靜脈，鈍性分離后腹膜，后用玻璃棒將上述血管予以保護(hù)，后剝離L5～6、L6～S1兩椎間盤左側(cè)腰大肌、韌帶及骨膜，暴露椎間盤左前緣，后用5號(hào)針頭(帶限位器)分別刺入上述椎間盤3 mm后退針。后生理鹽水1 ml、氨芐西林100 mg灌洗腹腔，分層縫合，消毒，無(wú)菌敷料創(chuàng)口，待大鼠復(fù)醒后禁食水12 h，每日皮下注射氨芐西林50 mg，連續(xù)3天。術(shù)后分籠飼養(yǎng)4周后，取大鼠雙側(cè)L5、L6夾脊穴(脊柱正中旁開3 mm)，直刺0.5 mm，行平補(bǔ)平泄手法3次后，留針持續(xù)20 min。每天1次，連續(xù)10天。

B組：造模方法同A組，不干預(yù)，正常分籠飼養(yǎng)。

C組：不行造模及干預(yù)，正常分籠飼養(yǎng)。

1.3.2 MRI檢查

造模后及干預(yù)后隨機(jī)(隨機(jī)排列表法)選取A組、B組、C組大鼠各5只，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后膠布固定于紙板上，行MRI檢查(矢狀位)。參數(shù)：T2WI：TR 值 2960.0 ms，TE 值 102.6 ms，F(xiàn)OV120 mm，層厚3 mm。參照 Thompson標(biāo)準(zhǔn)［1］，將退變椎間盤分為4級(jí)：1級(jí)：T2WI信號(hào)正常;2級(jí)：T2WI信號(hào)輕度減低;3級(jí)：T2WI信號(hào)中度減低;4級(jí)：T2WI信號(hào)明顯減低。測(cè)量椎間盤高度：測(cè)量L5～6、L6～S1椎間盤上下緣中點(diǎn)連線長(zhǎng)度。

1.3.3 椎間盤LI-1α、TNF-β酶聯(lián)免疫檢測(cè)

完成MRI檢查后，所有大鼠全部麻藥過(guò)量處死，取 L5～6、L6～S1椎間盤及終板，剔除附著組織，大量PBS緩沖液沖洗后，放在-80℃冰箱保存。后集中取出，稱重后分別放置研缽中，分3次反復(fù)加入液氮共約20 ml，研碎，加入PBS緩沖液1 ml后離心(10 000轉(zhuǎn)/min、持續(xù)10 min)，取上清液。ELISA操作步驟按試劑盒說(shuō)明逐步完成，后450 mm波長(zhǎng)測(cè)量測(cè)試各孔吸光度(OD值)。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差，檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠椎間盤MRI檢查

2.1.1 大鼠 L5～6、L6～S1椎間盤 MRI分級(jí)

表1 A、B、C 各組造模后、干預(yù)后 L5～6、L6～S1椎間盤MRI分級(jí)對(duì)照

由表1可見A、B組在造模后及干預(yù)后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)后大鼠椎間盤MRI表現(xiàn) 見封三圖1、2、3。圖1正常組MRI可見 L5～6、L6～S1椎間盤高度正常，椎間隙未見明顯狹窄，無(wú)椎間盤突出。圖2針刺干預(yù)組MRI表現(xiàn)為L(zhǎng)5～6、L6～S1椎間盤信號(hào)明顯降低，間盤內(nèi)含水量明顯降低，椎間盤高度下降，椎間隙變窄，椎間盤后緣部分向椎管內(nèi)突出，同時(shí)L5、L6、S1椎體部分信號(hào)降低。圖3對(duì)照組MRI表現(xiàn)與圖2表現(xiàn)基本相同。

2.1.3 大鼠 L5～6、L6～S1椎間盤高度比較

表2 A、B、C各組造模后、干預(yù)后椎間盤高度對(duì)照 (mm)

由表2可見，A、B 兩組 L5～6、L6～S1椎間盤在造模后、干預(yù)后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 大鼠椎間盤內(nèi)LI-1α、TNF-β濃度比較

表3 LI-1α、TNF-β濃度對(duì)照A、B、C各組干預(yù)后椎間盤

由表3可見，干預(yù)后A組與B組大鼠椎間盤LI-1α、TNF-β 濃度有顯著差異(P ＜0.01)。

3 討論

華佗夾脊穴(簡(jiǎn)稱夾脊穴)，從古至今備受歷代醫(yī)家重視，夾脊穴的應(yīng)用最早見于《素問(wèn)·刺瘧》：“十二瘧者，……又刺項(xiàng)以下俠脊者必已”。《素問(wèn)·繆刺論》亦曰：“邪客于足太陽(yáng)之絡(luò)，令人拘攣背急，引脅而痛，刺之從項(xiàng)始數(shù)脊椎俠脊，疾按之應(yīng)手如痛，刺之旁三瘠”。根據(jù)穴位的近治、遠(yuǎn)治作用，腰夾脊穴電針可以作用于局部即腰椎、椎間盤、附近肌肉神經(jīng)等(近治)，也可通過(guò)足太陽(yáng)膀胱經(jīng)聯(lián)系作用于下肢尤其是下肢后側(cè)、后外側(cè)區(qū)域(遠(yuǎn)治)。同時(shí)現(xiàn)代解剖證實(shí)腰夾脊穴位置在腰骨纖維孔、骨纖維管等結(jié)構(gòu)附近，上述結(jié)構(gòu)分別行走腰神經(jīng)后支、腰神經(jīng)后內(nèi)側(cè)支。

腰椎間盤突出癥機(jī)制尚未完全明確，傳統(tǒng)單純考慮機(jī)械性壓迫因素，但目前大量研究證實(shí)，其化學(xué)性炎癥介質(zhì)、免疫性炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子(CK)及神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)在其發(fā)生中起重要作用［2］。目前普遍認(rèn)為化學(xué)性刺激、炎性介質(zhì)浸潤(rùn)、免疫反應(yīng)、機(jī)械性壓迫等因素共同參與腰椎間盤突出癥的發(fā)病。而LI-1β、TNF-α則是與腰椎間盤突出癥、腰椎間盤退變密切相關(guān)的細(xì)胞因子。LI-1β是一種主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，主要在細(xì)胞免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作為炎癥介質(zhì)具有細(xì)胞損傷、破壞作用，Solovieva等［3］對(duì)IL-1多分子聚體和椎間盤的退變關(guān)系的相關(guān)性進(jìn)行了研究，認(rèn)為其是椎間盤退變的始動(dòng)因素。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等作用。田華等［4］通過(guò)大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)證實(shí)，TNF-α能明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞MMPI及MMP3的表達(dá)，對(duì)TIMPI的表達(dá)無(wú)影響，因此TNF-α對(duì)椎間盤細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)具有一定損傷作用。

MRI可以進(jìn)行矢狀位、冠狀位、橫截面等多平面成像，能對(duì)椎間盤退行性變進(jìn)行早期評(píng)估，是目前椎間盤退變最精確、最簡(jiǎn)便而又無(wú)創(chuàng)性的檢查方法［5～6］。隨著MRI技術(shù)的普及，該技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。椎間盤退變時(shí)，隨著椎間盤病例損傷的發(fā)生、水分、含氫量的改變，導(dǎo)致其形態(tài)和MRI信號(hào)減低，以T2加權(quán)限最為敏感，故該技術(shù)可以精確的反映腰椎間盤突出癥椎間盤在形態(tài)學(xué)上的變化，亦能相對(duì)精確的反映椎間盤含水量(含氫量)。

筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)針刺夾脊穴對(duì)腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤內(nèi)LI-1α、TNF-β濃度有明顯的抑制作用。同時(shí)證實(shí)短期內(nèi)(4周)針刺夾脊穴對(duì)腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤高度、退變程度無(wú)明顯影響，與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這在一定程度上證實(shí)了臨床針刺夾脊穴治療腰椎間盤突出癥一個(gè)常見問(wèn)題：部分患者針刺前后雖然影像學(xué)檢查無(wú)明顯差異(突出物位置、突出程度、突出物大小)，但癥狀能夠得到一定控制，可能與椎間盤及椎管內(nèi)炎性因子受到抑制，進(jìn)而椎間盤內(nèi)及椎管內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕、神經(jīng)根損害減輕相關(guān)。但針刺夾脊穴對(duì)腰椎間盤突出癥椎間盤遠(yuǎn)期病理進(jìn)程影響、遠(yuǎn)期MRI形態(tài)影響未能涉及，可在今后進(jìn)一步研究。

［1］ Masuda K，Aota Y，Muthleman C，et al.A novel rabbit model of mild，reproducible disa degeneration by an annulus needle puncture：correlation between the degree of disc injury and radiological and nistological appearance of disc degeneration［J］.spine，2005，30(1)：5-14

［2］ 韓麗麗，楊曉秋，劉丹彥.腰椎間盤突出癥相關(guān)炎性介質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(19)：113-114

［3］ Solovieva S，Kouhia S，Leino-Arjas P，et al.Interleukin-1 Polymorphisms and intervertebral disc degeneration［J］.Epidemiology，2004，15(5)：626-633

［4］ 田華，黨耕町，婁思權(quán)，等.腫瘤壞死因子α導(dǎo)致軟骨損傷的機(jī)制探討［J］.中華外科雜志，2000，38(1)：76

［5］ 尚鐵松，王云釗.腰椎問(wèn)盤退變的X線、MRI表現(xiàn)與病理對(duì)照［J］.中華放射學(xué)雜志，2002，36(9)：828-832

［6］ Xi YM，Hu YG.Development of intervertebral disc degeneration model［J］.Chin J Orthop，2000，20(6)：378-380