吳科榮，許 樂，張 立，侯 君，林宗明，蔣照輝

1.浙江省寧波市第一醫(yī)院泌尿腎病中心（寧波315000）

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院（上海200032）

我們曾經(jīng)報(bào)道了Notch 通路中重要配體蛋白Jagged1的表達(dá)與腎癌的分級、分期、腫瘤大小有關(guān)，Jagged1 的表達(dá)水平可以作為早期腎癌的獨(dú)立預(yù)后因子[1]。本研究綜合利用免疫組化和Western blot的方法，選擇2003年3月—2008年11月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腎癌手術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌的病例共計(jì)129 例，以更大樣本量進(jìn)一步檢測Notch1 與Jagged1 在腎癌組織及正常腎組織中的表達(dá),并探討蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，以及Notch1與Jagged1作為腎癌預(yù)后判斷指標(biāo)的價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 一般資料 本組129例中，男84例，女45例；年齡27～83 歲，平均55.5 歲。采用腎根治術(shù)122 例(94.6%)，腎部分切除術(shù)7 例(5.4%)。腫瘤按TNM(2002 AJCC)分期：Ⅰ期81 例, Ⅱ期17 例，Ⅲ期24例, Ⅳ期7例。腫瘤按Fuhrman分級：1級53例，2級54 例，3 級18 例，4 級4 例。腫瘤大小1.5～15 cm，平均5.3 cm。平均隨訪時(shí)間47.2個(gè)月。37例術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)(28.7%)，92例未發(fā)現(xiàn)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)(71.3%)。86例無瘤生存，6 例帶瘤生存。死亡37 例，其中31 例死于腫瘤，6例死于其他疾病。

1.2 研究對象 本項(xiàng)研究經(jīng)由復(fù)旦大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（NO.2008-98）。129例均取術(shù)后腎癌組織切片標(biāo)本，用于免疫組化染色，其中33例同時(shí)在距離癌組織邊緣5.0 cm 以外的正常組織處取材作為對照。組織標(biāo)本均采用10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。其中8例在術(shù)中即刻采集新鮮腎癌標(biāo)本及遠(yuǎn)離腫瘤的正常腎組織，用作Western blot檢測。組織在經(jīng)病理檢查，迅速導(dǎo)入液氮腫瘤庫保存。

1.3 Western blot 腎癌腫瘤組織及相應(yīng)正常組織共8 例，每20 mg 組織加入0.25 mL RIPARIPA 緩沖液，加入蛋白酶抑制劑混合物，組織勻漿使細(xì)胞充分裂解，離心獲取總蛋白。以Bradford法作蛋白定量，每個(gè)樣本取100 μg蛋白，加入上樣緩沖液，沸水浴中5 min，行7%SS-PAGE凝膠電泳130 V 2 h后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，90 V 90 min。轉(zhuǎn)磨結(jié)束后取下硝酸纖維素膜，5%牛奶封閉1 h，TBST 清洗，加入一抗（分別為兔抗人Notch1 多克隆抗體ab27526 ，Abcam，UK；羊 抗 人Jagged1 多 克 隆 抗 體sc-6011，Santa Cruz，USA）4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對應(yīng)二抗檢測。

1.4 免疫組化染色 采用EV二步法染色。常規(guī)脫蠟、脫水后，3%新鮮雙氧水避光孵育30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；熱抗原修復(fù)(抗原修復(fù)液為pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液)。滴加一抗（分別為兔抗人Notch1多克隆抗體ab27526，Abcam，UK；羊抗人Jagged1 多克隆抗體sc-6011，Santa Cruz，USA），室溫下孵育1 h，洗滌后再分別滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、封片。用已知乳腺導(dǎo)管癌陽性切片做陽性對照，以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.5 染色結(jié)果判定 染色片均由3位獨(dú)立的觀察者進(jìn)行染色評價(jià)，觀察者對病例信息均無任何了解。染色強(qiáng)度和染色程度的評價(jià)依據(jù)為既往的文獻(xiàn)[2]報(bào)道：先在低倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野（×40），計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞陽性百分比，定義細(xì)胞無染色為陰性，1%～20%細(xì)胞染色為1分，21%～60%細(xì)胞染色為2分，61%～100%細(xì)胞染色為3分。通過觀察高倍鏡（×200）下腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度，定義不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，深褐色為3 分。定義免疫染色評分為上述2 項(xiàng)指標(biāo)之和，并定義0～3分為蛋白低表達(dá)，4～6分為蛋白高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均選用SPSS 15.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 曲線和Cox Regression 模型。P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot Jagged1蛋白在6例標(biāo)本的腎癌組織中的表達(dá)水平（6/8，75.0%）高于在配對的正常組織中的表達(dá)，Notch1 蛋白在7 例標(biāo)本的腎癌組織中的表達(dá)水平（7/8，87.5%）高于在配對的正常組織中的表達(dá)（圖1）?？傮w上，Jagged1 蛋白及Notch1 蛋白在腎癌組織中的表達(dá)高于其周圍正常腎組織中的表達(dá)。

2.2 免疫組化染色 Notch1、Jagged1在腎癌組織中免疫組化染色主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞膜染色和（或）胞漿染色，小部分腫瘤細(xì)胞胞核亦染色（圖2、圖3）。Notch1、Jagged1在正常腎組織中的陽性表達(dá)率分別為36.4%(12/ 33)、42.4%(14/ 33)，在腎癌組織中的陽性表達(dá)率分別為95.3%(123/129) 、93.0%(120/129)。Notch1 及Jagged1 在腎癌組織中的表達(dá)均高于其在正常腎組織中的表達(dá)(P＜0.05)。

圖1 Western blot顯示Notch1蛋白及Jagged1蛋白在腎癌組織及正常腎組織中的表達(dá)1T～8T分別代表8例腫瘤組織，1N～8N分別代表8例正常腎臟組織

圖2 腎透明細(xì)胞癌組織Notch1免疫組化染色（×200）

圖3 腎透明細(xì)胞癌組織Jagged1免疫組化染色（×200）

2.3 Notch1、Jagged1 表達(dá)與腎癌臨床病理的相關(guān)性 隨著腎癌病理分級和臨床分期的增高，Notch1和Jagged1的表達(dá)水平都增高。Notch1和Jagged1的表達(dá)水平還與腫瘤大小有關(guān)：在直徑≥5 cm的腫瘤中的表達(dá)要高于在直徑＜5 cm 的腫瘤中的表達(dá)。兩者的表達(dá)水平在不同年齡和不同性別的病例中無顯著差異（表1）。

2.4 Notch1、Jagged1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 腫瘤復(fù)發(fā)與Notch1、Jagged1表達(dá)水平有關(guān)。復(fù)發(fā)組Notch1 和Jagged1蛋白的表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 Notch1、Jagged1 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)分析

通過Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行分析，總生存率（overall survival, OS）和無病生存率（disease free survival, DFS）均與Notch1、Jagged1 表達(dá)水平有關(guān)。低表達(dá)Notch1的病例組，其OS和DFS明顯優(yōu)于高表達(dá)Notch1 的病例組(P=0.028, 0.032)；低表達(dá)Jagged1的病例組OS和DFS明顯優(yōu)于高達(dá)Jagged1的病例組(P ＜0.001,＜0.001)（圖4）。單因素分析顯示，Notch1 與Jagged1 表達(dá)水平對腎透明細(xì)胞癌患者生存率影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過Cox Regression模型，納入包括年齡、性別、腫瘤大小、分期、分級及Notch1、Jagged1表達(dá)水平等因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Jagged1表達(dá)水平可以作為影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因子(P=0.035,0.028) (表2、表3)。而Notch1 作為獨(dú)立預(yù)后因子證據(jù)尚不充分(P=0.917，0.859)(表2、表3)。

3 討論

圖4 A、B：低表達(dá)Notch1的病例組，其總生存率（OS）和無病生存率（DFS）明顯優(yōu)于高表達(dá)Notch1的病例組(P=0.028, 0.032)；C、D：低表達(dá)Jagged1的病例組其總生存率（OS）和無病生存率（DFS）明顯優(yōu)于高達(dá)Jagged1的病例組(P<0.001, <0.001)

表2 多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析總生存率結(jié)果

表3 多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析無病生存率結(jié)果

腎透明細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最重要的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與Von Hippel—Lindau（VHL）抑癌基因失活有關(guān)。針對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受體的分子靶向治療，目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移性腎癌的一線治療方法，但仍存在有效率低、不良反應(yīng)明顯等缺點(diǎn)[3]。隨著對腎癌分子基因基礎(chǔ)的進(jìn)一步了解，更多的信號通路揭示與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病有關(guān)，對這些通路的研究，不僅可以進(jìn)一步完善腎癌發(fā)病機(jī)制，而且可能提供其他的治療靶向[3]。

Notch通路是進(jìn)化上十分保守的通路，其受體有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配體包括Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4。當(dāng)受體與配體結(jié)合后，受體的胞內(nèi)段NOTCHIC釋放，進(jìn)入細(xì)胞核并啟動下游靶基因如Hes基因等的表達(dá)。

Notch 通路廣泛表達(dá)于從無脊椎動物到哺乳動物等多個(gè)物種，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、遷徙、粘附等生命活動中都起到重要作用。異常的Notch信號已經(jīng)證明與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)。目前Notch與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系尚不十分明確，研究少且意見不一。Sun 等[4]的研究結(jié)果認(rèn)為，Notch 在腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)，而Rae[5]、Zhao 等[6]則發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌中Notch3、Jagged1 高表達(dá)。Sj?lund 等[7]在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株中測得Notch通路各組成蛋白高表達(dá)，這種表達(dá)與經(jīng)典通路中VHL、HIF-1a、HIF-2a的表達(dá)是相對獨(dú)立的。

在本項(xiàng)研究中，我們通過Western blot和較大樣本的免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1與Jagged1在腎透明細(xì)胞癌組織中存在表達(dá)，其陽性表達(dá)率高于在正常腎組織中的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Notch1和Jagged1的表達(dá)水平與腫瘤的病理分級、臨床分期和腫瘤大小均有關(guān)。這些結(jié)果有力提示，Notch通路在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到致癌的作用。

Notch通路的致癌作用可能與其在維持干細(xì)胞功能、抑制細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞凋亡中的功能有關(guān)[8]。另外，可能還與其在腫瘤血管生成中的作用有關(guān)。Patel 等[9]測定Notch 通路的配體之一DLL-4 在透明細(xì)胞癌中的表達(dá)，是在正常腎組織表達(dá)程度的9倍，并且這種表達(dá)與VEGF的表達(dá)正相關(guān)。Zeng等[10]報(bào)道了高表達(dá)Jagged1 頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)細(xì)胞更容易形成豐富的腫瘤血管和更大的瘤體。而Sj?lund等[7]采用γ分泌酶抑制劑抑制腎癌Notch 通路后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKi）p21 和p27 水平的上調(diào)，揭示Notch致癌的機(jī)制還可能與抑制p21和p27有關(guān)。

在腎癌預(yù)后判斷方面，國內(nèi)外學(xué)者在解剖水平、臨床水平、組織學(xué)水平和分子水平上發(fā)現(xiàn)了眾多影響因素。其中既有獨(dú)立的預(yù)后因素,也有協(xié)同作用的多個(gè)因素。在分子水平，研究較多的預(yù)后因子有HIF-1α、CAIX、VEGF 等。在本項(xiàng)研究中，我們探討了Notch1 和Jagged1 對腎癌預(yù)后的影響。單變量分析揭示Notch1 與Jagged1 表達(dá)水平對腎透明細(xì)胞癌患者生存率影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高表達(dá)Notch1或Jagged1預(yù)示腎癌不良預(yù)后。而在多變量分析中，Jagged1 的表達(dá)水平可以作為判斷腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因子，顯示出其在臨床上腎癌預(yù)后判斷中的意義和價(jià)值。國外有人報(bào)道，Notch通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著促癌的作用，并且Jagged1高表達(dá)提示乳腺癌患者的不良預(yù)后[11]。而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，Jagged1高表達(dá)的前列腺癌病例的腫瘤復(fù)發(fā)概率比Jagged1 低表達(dá)的前列腺癌病例高[12]。結(jié)合我們的結(jié)果，我們推測，Notch 通路的活化經(jīng)由Jagged1介導(dǎo)并與惡性腫瘤形成及疾病進(jìn)展有關(guān)。

與Jagged1不同，Notch1作為獨(dú)立預(yù)后因子依據(jù)尚不足。這其中的原因有：⑴Notch通路有多個(gè)受體和配體，而Notch1與Jagged1并非嚴(yán)格的一一配對關(guān)系。⑵Notch 與其他通路之間存在的交集對該通路的調(diào)控和影響。⑶病例數(shù)量不足，因此需要更加大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)Notch1 在腎癌預(yù)后判斷方面的作用和價(jià)值。

本研究通過使用Western blot 及免疫組化的方法，證實(shí)了Notch 通路重要組成蛋白Notch1 和Jagged1在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。單因素和多因素生存分析顯示兩者（尤其是Jagged1）對腎癌預(yù)后的影響，為指導(dǎo)臨床上腎癌預(yù)后判斷提供了新的指標(biāo)。Notch 通路作為腫瘤治療靶點(diǎn)待進(jìn)一步探索，具有廣闊的研究前景和價(jià)值。

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