徐梅華, 蔡克銀, 趙 勇

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院, 武漢 430070）

大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一, 大腸癌的早期診斷是提高大腸癌患者生存率及生活質量的關鍵所在。由于年老體弱及合并有心腦血管并發(fā)癥, 許多老年患者常不能耐受電子結腸鏡等有創(chuàng)檢查。近年研究發(fā)現(xiàn), 端粒酶的活化是腫瘤細胞獲得“永生化”的關鍵步驟[1-3]。但目前關于端粒酶對大腸癌診斷意義的研究均建立在侵入性取材的基礎上, 尋找簡單、敏感、特異性高的非侵入性取材方式診斷大腸癌具有廣闊的應用前景。正常腸道黏膜每天都有大量細胞更新脫落入腸腔, 隨糞便排出體外,檢測糞便中腸道黏膜脫落細胞端粒酶的活化有可能為結直腸癌無創(chuàng)診斷的新途徑。本研究分析了30例大腸癌、30例大腸腺瘤患者及20例正常對照組糞便腸脫落細胞端粒酶活性表達及對應的30例大腸癌組織、30例大腸腺瘤組織、20例正常對照黏膜組織端粒酶活性的表達情況, 以探討糞便腸脫落細胞端粒酶活性檢測在大腸癌早期診斷中的潛在應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2009年10月～2010年10月廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院收治的30例老年大腸癌、30例老年大腸腺瘤、20例非大腸癌對照組標本, 均經手術或內鏡病理證實。30例大腸癌患者中, 男 21例, 女 9例, 年齡 65～82歲, 平均（72.5±8.3）歲; 30例老年大腸腺瘤患者中, 男19例, 女11例, 年齡65～80歲, 平均（70.3±6.5）歲; 另選擇20例年齡、性別匹配的志愿者為正常對照組, 其腸鏡檢查均為陰性結果。糞便標本于術前或內鏡檢查前收集, 收集后2 h內送至實驗室, 分裝后置－80℃冰箱。

1.2 主要試劑

端粒酶 PCR-ELISA檢測試劑盒, 引物 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′。

1.3 方法

1.3.1 端粒酶提取 取保存?zhèn)錂z的糞便腸脫落細胞, 手術或腸鏡切除的腫瘤、腺瘤、正常黏膜組織標本30 mg, 經PBS或生理鹽水漂洗, 4℃10000 r/min離心1 min, 棄上清,將沉淀組織搗碎, 加入150 μl洗液洗滌, 4℃10000 r/min離心1 min, 棄洗液。沉淀加入50μl細胞裂解液懸浮, 置冰浴30 min, 4℃14000 r/min離心20 min, 取上清2μl做為端粒重復擴增程序（telomeric repeat amplification protocol,TRAP）反應模塊。

1.3.2 PCR反應擴增 提取液在PCR循環(huán)儀進行端粒重復序列擴增。取TRAP反應管, 各加入45μl反應混合物,并加入 2 μl已處理的標本, 混勻, 加入 30 μl液體石蠟, 離心數秒, 置25℃水浴保溫30 min, 取出后于PCR儀上進行擴增反應。

1.3.3 產物雜交和ELISA反應 按端粒酶PCR-ELISA檢測試劑盒說明進行。

1.3.4 酶標儀結果判定 波長 450/595nm處讀取吸光度（OD）值。空白對照, OD值≤0.01; 陰性對照, OD值≤0.025; OD值＜0.05為陰性, OD值＞0.05為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理, 采用c2檢驗進行顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組一般臨床特征比較

大腸癌組、腺瘤組、正常對照組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 糞便腸脫落細胞端粒酶活性檢測

大腸癌組及腺瘤組糞便腸脫落細胞端粒酶陽性表達率均顯著高于對照組（83.3%，63.3%vs5.0%，P＜0.01）,大腸癌組亦顯著高于腺瘤組（83.3%vs63.3%，P＜0.05）。

2.3 黏膜組織端粒酶活性檢測

大腸癌組及腺瘤組組織細胞端粒酶活性陽性表達率均顯著高于正常對照組（90.0%，73.3%vs5.0%，P＜0.01）, 大腸癌組與腺瘤組比較, 組織細胞端粒酶活性差異亦具有統(tǒng)計學意義（90.0%vs73.3%，P＜0.05）。27例大腸癌組織端粒酶表達陽性的患者中有25例其對應的糞便腸脫落細胞端粒酶活性也呈陽性表達;22例大腸腺瘤組織端粒酶表達陽性的患者有19例其對應的糞便腸脫落細胞端粒酶活性也呈陽性表達。

3 討 論

大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一, 發(fā)病率及死亡率呈逐年增高趨勢。大腸癌的早期診斷是提高大腸癌患者生存率及生活質量的關鍵所在。傳統(tǒng)的檢測手段如結腸鏡、鋇灌腸氣鋇雙重造影等檢查因為禁食、導瀉等腸道準備, 檢查過程痛苦而繁瑣, 而老年患者作為大腸癌的高發(fā)人群常因合并有心腦血管及其他系統(tǒng)并發(fā)癥而無法耐受上述檢查。而糞便潛血試驗及血清腫瘤標記物檢測如癌胚抗原等作為無創(chuàng)檢測手段, 由于缺乏敏感性及特異性,其臨床應用價值受到質疑。現(xiàn)代醫(yī)學亟需一種簡便、無創(chuàng)、安全、可靠的技術來替代上述傳統(tǒng)的大腸癌檢測手段。糞便基因檢測由于具備上述諸多優(yōu)勢, 已成為近年來歐美等國大腸癌研究的熱點[4,5]。

有研究指出, 正常腸道黏膜每天都有大量細胞更新脫落入腸腔, 隨糞便排出體外[6]。而大腸癌細胞增殖代謝較正常腸道黏膜細胞更為旺盛, 只要采取適當的方法提取出糞便中脫落細胞的DNA, 經過PCR擴增相關突變基因, 再通過適當的方法對擴增產物進行分析, 即可以通過糞便途徑對大腸癌進行早期診斷。

大腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段、多步驟漸進演化的過程, 該過程涉及到眾多基因及基因調控的異常。端粒和端粒酶是近年來生命科學研究的熱點。端粒是真核生物細胞染色體末端一種由簡單重復序列及相關蛋白組成的結構, 其生物學功能是防止染色體DNA降解、末端融合、非正常重組, 從而保證染色體的完整性和穩(wěn)定性。端粒酶屬于逆轉錄酶, 是核糖核蛋白復合體, 激活后能以自身的RNA為模板, 合成端粒序列并加到染色體的3′端, 填補復制過程中新合成的 DNA 鏈 5′端留下的缺口,使端粒延長, 從而延長細胞壽命。端粒酶活化在細胞癌變中起重要作用, 由于端粒酶的激活, 使端粒的長度維持一種動態(tài)平衡, 細胞得以無限期的增殖下去, 腫瘤細胞獲得了永生化能力。

本研究結果顯示, 大腸癌患者糞便中端粒酶活性檢測陽性率為 83.3%, 在腺瘤患者糞便中端粒酶活性檢測陽性率為 63.3%, 較正常對照組檢出率明顯升高。糞便腸脫落細胞基因突變體、腫瘤標志物的檢測能否忠實反映大腸腫瘤組織的異常狀況, 即腫瘤組織與糞便中基因突變體檢出的符合率, 近年的研究結果給予了肯定的回答[7,8]。本組 27例大腸癌組織端粒酶表達陽性的患者有25例其對應的糞便腸脫落細胞端粒酶活性也呈陽性表達。22例大腸腺瘤組織端粒酶表達陽性的患者有19例其對應的糞便腸脫落細胞端粒酶活性也呈陽性表達也說明了這一點。

本研究表明, 糞便端粒酶活性檢測對于早期診斷大腸癌及癌前病變具有較高的價值。糞便端粒酶活性檢測有望成為大腸癌, 尤其是老年大腸癌患者早期無創(chuàng)診斷的一個新途徑。

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