周佳 綜述 李青峰 審閱

應力介導細胞凋亡的研究進展

周佳 綜述 李青峰 審閱

應力改變介導的細胞凋亡與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，研究該機制可為相關疾病提供預防、治療的方法。本文就細胞凋亡的基本特點、應力介導細胞凋亡的相關研究、應力模型的建立及凋亡檢測的方法等方面進行綜述。

凋亡 應力 檢測

細胞凋亡（Apoptosis）是由特定基因控制的細胞自主的、有序性的死亡，又稱程序性細胞死亡 （Programmed Cell Death，PCD）[1]。外界環(huán)境因素改變可以觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序，而引發(fā)細胞凋亡。細胞凋亡是細胞的基本特征之一，與細胞增殖共同維持機體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究應力與細胞凋亡的相關性，可以有效地了解與組織應力改變相關的疾病的發(fā)生、發(fā)展情況，探索與組織應力改變相關的治療方法的可行性。本文就細胞應力改變介導的細胞凋亡方面的研究進行綜述。

1 細胞凋亡概述

研究證實，細胞凋亡存在兩條起始途徑：外源性途徑和內(nèi)在途徑[2]。外源性途徑即死亡受體途徑，外界刺激通過細胞膜上的凋亡受體觸發(fā)細胞凋亡；內(nèi)在途徑又稱為線粒體途徑，細胞環(huán)境改變后，線粒體膜電位改變觸發(fā)細胞凋亡。兩種途徑最終均激活caspases-3（半胱氨酸蛋白酶），完成細胞凋亡。細胞應力發(fā)生一定程度改變時，胞內(nèi)的內(nèi)質網(wǎng)將受力信號傳遞給線粒體，細胞可以通過內(nèi)在途徑發(fā)生凋亡。

1.1 細胞調亡的形態(tài)學特征和生物化學改變

典型凋亡細胞的形態(tài)學變化過程包括：早期細胞體皺縮，細胞器完整但緊密壓縮，核收縮，染色質濃縮于核膜周邊，然后核裂解成碎塊，胞膜逐漸突起，出芽形成大皰，而后大皰從凋亡細胞表面脫離出來，形成“凋亡小體”，最后凋亡小體被吞噬細胞吞噬，一般不出現(xiàn)炎癥反應[3-5]。

凋亡細胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細胞膜內(nèi)側的磷脂酸酰氨酸（Phosphatidylserine，PS）遷移至脂雙層外側。

細胞凋亡時，核小體間的雙鏈DNA的斷裂，導致形成多個180～200 bp，或其整數(shù)倍為單位的DNA片段。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可見特征性梯狀帶。

1.2 細胞凋亡的調控

細胞凋亡是由多基因控制，在多因素參與下通過復雜的調節(jié)網(wǎng)絡實現(xiàn)的。目前，對凋亡的調控已經(jīng)有了一定的了解，在基因的表達層面，促凋亡基因 ced-3、ced-4、c-Myb、c-Myc、p53、MyD118、GADD45、ICE、Bax 等，抑凋亡基因 ced-9、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1、MyD116等參與細胞凋亡的調控；在凋亡過程中 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號，TNF-α、INF-γ等細胞因子，F(xiàn)as、TRAIL、APO-3、caspase 蛋白水解酶家族等因子在其中發(fā)揮了重要的作用[6-8]。

2 細胞應力改變與細胞凋亡的相關研究

細胞存活的應力條件將對細胞的凋亡行為產(chǎn)生重要的影響，近年來隨著生物學家對這一問題的關注，細胞應力與細胞凋亡的相互作用關系已逐步得到揭示。Fong等[9]采用應力模式化培養(yǎng)的顱骨成骨細胞來控制細胞的形態(tài)和面積，研究結果表明成骨細胞的凋亡率隨著鋪展面積的增大而降低。細胞的活性受面積的影響，同時細胞的鋪展形態(tài)也有重要的調節(jié)作用。郭子義等[10]研究了動脈血流切應力變化對血管平滑肌細胞（Vascula smooth muscle cells，VSMC）凋亡的影響，結果顯示零應力條件下VSMC的凋亡和去分化明顯增加。Sotoudeh等[11]報道在高血壓條件下可引起死亡受體的聚集，從而導致VSMC的凋亡。胡佳等[12]指出，流體剪切力達到40 cmH2O時影響血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡進程并有一定時相性的變化規(guī)律，同時P53、Bcl-2與Fas蛋白在凋亡發(fā)生發(fā)展中的不同時期起到相應的調控作用。佟俊杰等[13]的實驗證實了周期性張應力能導致牙周成纖維細胞凋亡的發(fā)生，從而為臨床咬牙合創(chuàng)傷即咬牙合力造成牙周損害疾病的預防和治療提供了理論依據(jù)。Hawwa等[14]通過實驗證實，肺成纖維細胞在周期性牽引力的作用下，凋亡現(xiàn)象較對照組增加3倍以上。Lo等[15]在包被膠原并有硬度梯度的聚丙烯酰胺片上培養(yǎng)3T3細胞，發(fā)現(xiàn)3T3成纖維細胞可以探測出基底的硬度并作出響應；當細胞從軟基底區(qū)域進入硬基底區(qū)域時，細胞會轉向90°，其遷移的速度會瞬時增加，細胞鋪展面積增加。從以上論述可見，細胞應力條件對細胞凋亡的行為有著重要的影響，并為各種臨床疾病的預防、治療提供理論指導。

3 應力作用模型

1975年，Rodan等用軟骨和骨細胞進行流體靜壓加載，開創(chuàng)了機械應力應用于細胞和組織研究的方法。隨后的研究中，出現(xiàn)了多種多樣的裝置用于構建受力模型[16-17]。

3.1 壓應力作用模型

3.1.1 重物加力法

重物加力法是將重物直接對培養(yǎng)的細胞和組織加力的方法，通過改變物體的重量調節(jié)施加壓應力的大小。該加力方法產(chǎn)生持續(xù)性靜壓力。

3.1.2 液壓加力法

液壓加力法是利用流體靜壓對在體外培養(yǎng)的細胞和組織加力的方法，應用高壓裝置或減壓裝置改變培養(yǎng)液對細胞和組織產(chǎn)生的靜壓力大小。包括正壓與負壓兩種方式。流體靜壓作用培養(yǎng)細胞和組織的研究模型設備簡單，刺激均勻，易于傳導靜止或短時的應力。

3.1.3 離心加力法

離心力也被認為是一種壓應力。有學者用水平微板轉盤對培養(yǎng)的細胞施加離心力。離心加力法通過調節(jié)旋轉半徑、轉速來改變加力大小，可以產(chǎn)生持續(xù)性或間歇性壓力[18]。

3.2 牽張力作用模型

目前，牽張力主要是由基底形變加力模型產(chǎn)生，使用最廣的是以基底形變?yōu)榛A的加力裝置。其基本原理是通過基底彎曲變形或水平拉伸使附著于基底生長的細胞被拉伸或壓縮。1991年，Andersen等最早報道了用“圓頂”造成基底形變，對細胞施加最大1%雙軸張應變的方法。

3.2.1 平面外牽拉基底變形的應力作用模型

平面外牽拉基底變形的應力作用模型是通過基底彎曲變形來產(chǎn)生牽張力的模型。

3.2.1.1 單向牽拉彈性膜片變形應力作用模型

最初有學者在矩形的基底下放置半圓形支架，形成基底的形變，產(chǎn)生牽張力。近年來出現(xiàn)了四點彎曲模型，利用呈矩形的四個著力點，垂直對基底加力，基底形變產(chǎn)生牽張力。單向牽張力發(fā)生模型穩(wěn)定，尤其適用于有方向性應力要求的細胞和組織的研究[19]。

3.2.1.2 非單向牽拉彈性膜片變形的應力作用模型

當基底是圓形時，將力垂直作用于基底，基底形變產(chǎn)生的牽張力是多方向的。目前最常用的裝置是利用負壓吸引形成基底形變。隨著裝置的不斷改進，該作用模型產(chǎn)生的牽張力穩(wěn)定、精準，操作便捷，但仍存在基底受力不均的缺點[20]。

3.2.2 平面作用牽拉基底變形的應力作用模型

平面作用牽拉基底變形的應力作用模型中，細胞培養(yǎng)的基底放置在一個平臺上，基底的四周與牽拉裝置相連，例如Flexcell系統(tǒng)通過負壓使彈性膜邊緣拉伸，改變其長度形成基底的牽張力。通過調節(jié)彈性底面的水平形變量，控制細胞受力的大小和方向?？梢援a(chǎn)生單向牽張力、雙向牽張力。如果平面基質是圓形的，在中央圓形基底部位的膜即受到各個方向均勻的牽張力[21]。

3.3 流體切變應力模型

其原理是使用流體切變應力對細胞進行作用。包括兩種裝置：錐體-平面系統(tǒng)，通過調整錐體的形狀與旋轉錐體的角速度獲得流體切變力；另一種裝置則稱為平行平板流動槽，利用裝置入口與出口的壓力變化來改變流體切變率，通過調整裝置的尺寸以及比例獲得多種流體切變參數(shù)[22]。

4 細胞凋亡的檢測方法

4.1 電子顯微鏡細胞形態(tài)學檢測

透射電鏡和掃描電鏡下可以觀察到凋亡細胞的超微結構特征的改變。此方法是定性凋亡細胞的可靠方法，為細胞凋亡形態(tài)學觀察的金指標。

4.2 細胞生化檢測

DNA Ladder帶檢測，細胞凋亡時，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時呈現(xiàn)特征性的180～200 bp DNA階梯狀條帶。

由末端脫氧核糖核酸轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）介導的 dUTP 缺口末端標記技術（TUNEL），是原位末端標記法（In Situ End-Labeling，ISEL）中的一種。其基本原理是將滲入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶的催化下與凋亡細胞因內(nèi)源性核酸酶激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結合，再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。即將熒光素或同位素標記的dUTP接到斷裂DNA的3'-0H端發(fā)生聚合反應，然后進行檢測[23]。

線粒體膜電位的降低是凋亡細胞早期的特征性改變，發(fā)生在形態(tài)學改變之前，且被認為是不可逆的。由于線粒體膜電位的存在，能使一些親脂性的陽離子熒光染料與線粒體的基質相結合，這些染料如羅丹明123、JC-1等與線粒體的基質結合可以用來檢測線粒體膜電位的變化[24]。當細胞MMP降低時，其熒光強度降低，也就是說線粒體基質的熒光增強或減弱能說明線粒體內(nèi)膜電負性增強或降低。

4.3 免疫學檢測方法

免疫組化廣泛應用于凋亡細胞的基因表達、細胞內(nèi)各因子水平和蛋白質含量等的分析。

4.4 流式細胞儀檢測

流式細胞儀不僅可以從形態(tài)上分析細胞是否存在凋亡，還可從染色質、離子、蛋白等多方面檢測細胞凋亡[25]。

碘化丙啶（Propidum iodide，PI）染色法DNA含量測定，PI熒光染料分子不能進入完整的細胞膜，但細胞經(jīng)固定、打孔后PI可直接進入細胞，插入到DNA堿基對之間，流式細胞儀通過檢測摻入的PI熒光強度來顯示DNA含量。凋亡細胞DNA含量降低，故在正常的G0/G1峰前有一亞G0/G1峰出現(xiàn)，即為凋亡峰（AP峰）。

膜聯(lián)蛋白法：磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。膜聯(lián)蛋白（Annexin V）是一種分子量為35～36 KDa的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將膜聯(lián)蛋白V進行熒光素標記，以標記了的膜聯(lián)蛋白V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

4.5 分子探針檢測

分子探針在分子影像學中是指對某一特定生物分子（如蛋白質、DNA、RNA）具有特異性靶向的、并能夠進行體內(nèi)或/和體外示蹤的標記分子，這些標記分子能夠在體內(nèi)或/和離體反映其靶生物分子的量或/和功能，通常由信號組件和親和組件兩部分組成[26－27]。在細胞凋亡的分子成像研究中，根據(jù)信號組件的成分可分為放射性核素、熒光素、含熒光基團標記的分子探針。凋亡研究的親和組件有兩種：以Caspase為靶標的凋亡影像探針和以Annexin V親和組件為靶標的凋亡探針。

細胞形式的凋亡檢測適用于以上各種類型的檢測方法。組織形式的凋亡檢測可采用電鏡檢測、TUNEL法。分子影像技術可用于在體凋亡檢測。

5 展望

應力條件下細胞凋亡行為的改變與多種臨床疾病相關。在整形外科領域，牽拉顱面骨獲得增生的骨質、應用軟組織擴張器獲得額外的皮膚，這些以機械力刺激組織再生的技術已在臨床中廣泛應用，但作用機理的研究仍不夠完善。在這些機械力刺激組織再生的現(xiàn)象中，應力介導凋亡狀態(tài)改變也是必要的研究內(nèi)容之一。分子探針提供了一種在體研究的凋亡檢測手段。分子影像學也以一種全新的科學觀察方法即非侵入性的方式，實現(xiàn)對活體內(nèi)參與生理和病理過程的分子進行定性或定量的可視化分析，為細胞凋亡成像研究引入了新的思維方式和研究手段。

[1]Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

[2]Giansanti V,Torriglia A,Scovassi AL.Conversation between apoptosis and autophagy:"Is it your turn or mine"[J]?Apoptosis,2011,16(4):321-333.

[3]Hacker G.The morphology of apoptosis[J].Cell Tissue Res,2000,301(1):5-17.

[4]Telford WG,King LE,Fraker PJ.Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry[J].Cytometry,1992,13(2):137-143.

[5]Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recongnition and removal by macrophages[J].J Immunol,1992,148(7):2207-2216.

[6]Kim MO,Moon DO,Choi YH,et al.Platycodin D induces mitotic arrest in vitro,leading to endoreduplication,inhibition of proliferation and apoptosis in leukemia cells[J].Int J Cancer,2008,122(12):2674-2681.

[7]Yao J,Jiang Z,Duan W,et al.Involvement of mitochondrial pathway in triptolide-induced cytotoxicity in human normal liver L-02 cells[J].Biol Pharm Bull,2008,31(4):592-597.

[8]Raff M.Cell suicide for beginners[J].Nature,1998,396(6707):119-122.

[9]Fong KD,Song HM,Nacamuli RP,et al.Apoptosis in a rodent model of cranial suture fusion:in situ imaging and gene expression analysis[J].Plast Reconstr Surg,2004,113(7):2037-2047.

[10]郭子義,嚴志強,張明亮,等.血流切應力變化導致頸總動脈重建及其對血管平滑肌細胞凋亡和分化的影響[J].醫(yī)用生物力學,2008,23(1):61-65.

[11]Sotoudeh M,Li YS,Yajima N,et al.Induction of apoptosis in vascular smooth muscle cells by mechanical stretch[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(5):1709-1716.

[12]胡佳,郭應強,張爾永,等.流場壓力變化對體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞增殖和凋亡及其相關蛋白的影響[J].生物醫(yī)學工程學雜志,2009,26(4):837-841.

[13]佟俊杰,袁曉,張月,等.周期性張應力對成纖維細胞凋亡的影響及其調控機制[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(33):6108-6112.

[14]Hawwa RL,Hokenson MA,Wang Y,et al.IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch[J].Pediatr Pulmonol,2011,46(7):640-649.

[15]Lo CM,Wang HB,Dembo M,et al.Cell movement is guided by the rigidity of the substrate[J].Biophys J,2000,79(1):144-152.

[16]Lee AA,Delhaas T,Waldman DA,et al.An equibiaxial strain system for cultured cells[J].Am J Physiol,1996,271(4 Pt 1):1400-1408.

[17]Brown TD.Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro:a review[J].J Biomech,2000,33(1):3-14.

[18]Buckley CT,Thorpe SD,Kelly DJ.Engineering of large cartilaginous tissues through the use of microchanneled hydrogels and rotational culture[J].Tissue Eng Part A,2009,15(11):3213-3220.

[19]Owan I,Burr DB,Turner CH,et al.Mechanotransduction in bone:osteoblasts are more responsive to fluid forces than mechanical strain[J].Am J Physiol,1997,273(3 Pt 1):810-815.

[20]趙志河,李宇.正畸牙移動細胞生物力學研究進展[J].醫(yī)用生物力學,2010,25(6):393-398.

[21]Colombo A,Cahill PA,Lally C.An analysis of the strain field in biaxial Flexcell membranes for different waveforms and frequencies[J].Proc Inst Mech Eng H,2008,222(8):1235-1245.

[22]Standley PR,Cammarata A,Nolan BP,et al.Cyclic stretch induces vascular smooth muscle cell alignment via NO signaling[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(5):1907-1914.

[23]崔巍,唐炳華,王碩仁.細胞凋亡檢測方法探討[J].細胞生物學雜志,2007,29(5):777-782.

[24]Ravagnan L,Roumier T,Kroemer G.Mitochondria,the killer organelles and their weapons[J].J Cell Physiol,2002,192(1):131-137.

[25]娜仁圖娜拉,閆雷,趙瑞杰,等.流式細胞術及其在細胞凋亡檢測中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(27):5353-5356.

[26]唐敏,曾文彬,曹亞.分子探針在細胞凋亡檢測中的研究進展[J].中國生物工程雜志,2011,31(6):124-128.

[27]Nunn AD.The cost of developing imaging agents for routine clinical use[J].Invest Radiol,2006,41(3):206-312.

Research Progress of Stress-induced Apoptosis

ZHOU Jia,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.

LI Qingfeng(E-mail:liqfliqf@yahoo.com.cn).

Apoptosis;Mechanical stress;Detection

Q255

B

1673－0364（2012）04－0235－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.016

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

李青峰（E-mail：liqfliqf@yahoo.com.cn）。

【Summary】Mechanical stress-induced apoptosis,as programmed cell death,is often correlated with many diseases.Research of mechanical stress-induced apoptosis could provide the prevention and therapy of relative diseases.In this review,the basic features of apoptosis,relative research of stress-induced apoptosis,the establishment of the strain model and the methods of cell apoptosis detection are all reviewed.The research direction of stress-induced apoptosis is also proposed.

2012年4月12日；

2012年5月7日）