謝方南 綜述 康寧 肖苒 審校

間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性能的影響因素

謝方南 綜述 康寧 肖苒 審校

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell，MSC）因高度的自我增殖與多向分化能力在再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，MSC成骨分化的研究很多，但體外、內(nèi)的成骨效率仍然較低。因此，提高M(jìn)SC的成骨性能成為關(guān)注熱點(diǎn)。MSC成骨性能受多方面因素的影響，我們從細(xì)胞來(lái)源、分離純化、誘導(dǎo)策略及血管化等4個(gè)方面對(duì)影響MSC成骨性能的因素進(jìn)行綜述。

間充質(zhì)干細(xì)胞 組織工程 細(xì)胞來(lái)源 分離純化 誘導(dǎo)策略 血管化

組織工程技術(shù)為臨床大面積骨缺損的修復(fù)提供了新的思路。然而，在基于MSC的組織工程骨缺損修復(fù)過(guò)程中，MSC的成骨效果并不理想，主要表現(xiàn)為MSC體內(nèi)、外的成骨效率較低。MSC的成骨性能受多方面因素的影響，本文從細(xì)胞來(lái)源、分離純化、誘導(dǎo)策略及血管化四個(gè)方面對(duì)MSC成骨性能的影響作如下綜述。

1 細(xì)胞來(lái)源對(duì)MSC成骨性能的影響

MSC可來(lái)源于體內(nèi)的多種組織，如骨髓、脂肪、肌肉、肝臟、外周血、臍帶、胎盤(pán)等，組織來(lái)源的不同及供者年齡的差異均會(huì)影響其成骨性能。

Pascale等[1]將胎兒骨髓、外周血、肝臟等3種不同組織來(lái)源的MSC進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的MSC成骨性能最強(qiáng)，外周血來(lái)源次之，肝臟來(lái)源最弱。Pilz等[2]比較了胎盤(pán)、骨髓來(lái)源的MSC表面抗原和成骨分化能力，結(jié)果顯示骨髓來(lái)源MSC的CD146和堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)水平顯著高于胎盤(pán)來(lái)源MSC，表現(xiàn)出更高的成骨性能。另外，對(duì)臍帶血、脂肪、骨髓等組織來(lái)源MSC的成骨性能的比較研究，證實(shí)了骨髓來(lái)源MSC表現(xiàn)出最高的成骨性能，而脂肪組織來(lái)源MSC成骨性最低[3]。

針對(duì)39名37～86歲男性骨髓MSC成骨性的比較研究，發(fā)現(xiàn)人骨髓MSC成骨性能隨著年齡增加而逐漸降低[4]。Zhang等[5]研究了年齡對(duì)C57BL/6鼠骨髓MSC成骨分化性能的影響，發(fā)現(xiàn)18周齡以后的C57BL/6鼠其MSC數(shù)量與成骨分化能力會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而顯著下降。Zhou等[6]也報(bào)道了17～90歲骨髓捐獻(xiàn)者骨髓MSC成骨性能的變化，發(fā)現(xiàn)STRO-1+MSC細(xì)胞數(shù)量，隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著減少，成骨相關(guān)基因（RUNX2、OSTERIX、ALP、BSP、OC） 的表達(dá)以及 ALP 活力明顯降低。

骨髓來(lái)源的MSC在骨缺損修復(fù)過(guò)程中應(yīng)用最為廣泛。老年患者的骨髓內(nèi)MSC數(shù)量明顯減少、抗氧化能力下降、衰老細(xì)胞增多，但增殖分化能力并沒(méi)有明顯改變，而且適當(dāng)刺激仍具有較強(qiáng)的遷移能力。因此，有人提出應(yīng)增強(qiáng)其向損傷部位的歸巢能力以促進(jìn)修復(fù)[7]。

2 分離純化對(duì)MSC成骨性能的影響

目前，大多數(shù)研究主要利用MSC貼壁生長(zhǎng)的特性對(duì)其進(jìn)行分離純化。這種方法得到的MSC存在高度異質(zhì)性，其中包括胚胎樣細(xì)胞、MSC以及不同程度的定向分化細(xì)胞群。不同亞群的細(xì)胞具有不同的增殖和分化潛能，其中生存壽命較短、成骨性能較差的細(xì)胞將會(huì)影響最終的成骨效率。

為了獲取成骨性能優(yōu)良且生存時(shí)間較長(zhǎng)的MSC亞群，有研究針對(duì)分離方式進(jìn)行了改進(jìn)。Liu等[8]將第2代鼠骨髓MSC懸液與二氧化硅顆粒共培養(yǎng)1 h后，利用密度梯度離心法分離出一類(lèi)高度純化并具有較強(qiáng)成骨分化潛能的MSC亞群（M2），在體外成骨誘導(dǎo)28 d后，96%的M2細(xì)胞能合成骨鈣素，ALP活性動(dòng)態(tài)升高并伴有明顯的骨基質(zhì)鈣化；M2細(xì)胞同種異體異位成骨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植12 d后，可以在組織學(xué)水平檢測(cè)到ALP、骨橋蛋白、骨鈣素以及局部基質(zhì)的鈣化。Rada等[9]用包被不同抗體（CD29、CD44、CD49d、CD73、CD90、CD105、p75以及STRO-1）的免疫磁珠顆粒，從人脂肪MSC中分選出不同的細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)用抗STRO-1的免疫磁珠分選出的細(xì)胞亞群成骨能力最高，抗CD90、抗CD49d以及抗p75分選出的細(xì)胞也具有較高的成骨分化能力。此外，對(duì)流離心洗脫法可在原代人臍帶MSC中分離出一種細(xì)胞直徑在11 μm左右的細(xì)胞群，流式細(xì)胞分選發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞群高表達(dá)CD44、CD73、CD90及CD105等干細(xì)胞標(biāo)記物，并且比其他細(xì)胞亞群更年輕、增殖能力更強(qiáng)，有可能成為另一應(yīng)用前景廣闊的MSC 來(lái)源[10]。

用這些方法都能使MSC成骨性能得到一定程度的提高，但是由于目前仍然缺乏MSC及其定向分化的特異性標(biāo)志物，MSC及不同亞群的分離純化技術(shù)仍未取得突破性進(jìn)展。

3 誘導(dǎo)策略對(duì)MSC成骨性能的影響

基于MSC的骨缺損治療，有研究認(rèn)為，適當(dāng)?shù)捏w外誘導(dǎo)可促進(jìn)MSC的體內(nèi)成骨效率[11－12]。根據(jù)骨發(fā)生過(guò)程中膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種方式，對(duì)MSC體外誘導(dǎo)主要有成骨誘導(dǎo)與成軟骨誘導(dǎo)兩種策略。

3.1 成骨誘導(dǎo)

研究發(fā)現(xiàn)，將成骨細(xì)胞接種于陶瓷支架可使其通過(guò)膜內(nèi)成骨的方式生成骨組織[13]。因此，通常在體外對(duì)MSC成骨誘導(dǎo)2～3周，使其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定成骨表型之后，再應(yīng)用于組織工程骨的構(gòu)建。Eslaminejad等[14]將犬MSC體外成骨誘導(dǎo)3周后，進(jìn)行光學(xué)和透射電鏡觀察，并檢測(cè)ALP及軟骨相關(guān)基因的表達(dá)，鏡下可見(jiàn)很多類(lèi)似于板層骨結(jié)構(gòu)的骨結(jié)節(jié)樣細(xì)胞團(tuán)，表面覆蓋一層骨膜樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞團(tuán)中發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的類(lèi)骨細(xì)胞以及垂直排列的膠原纖維束，但未檢測(cè)到軟骨相關(guān)基因的表達(dá)。

3.2 成軟骨誘導(dǎo)

研究表明，未經(jīng)誘導(dǎo)的MSC植入體內(nèi)后也可通過(guò)軟骨內(nèi)骨化的方式成骨[13]。因此，適當(dāng)?shù)捏w外成軟骨誘導(dǎo)可能會(huì)有助于軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生。Janicki等[15]對(duì)人骨髓MSC體外成軟骨誘導(dǎo)促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨的方式進(jìn)行了研究。他們將MSC種植在β-TCP支架上，其中一組復(fù)合物經(jīng)過(guò)體外成軟骨誘導(dǎo)6周后植入裸鼠皮下，另一組未經(jīng)任何誘導(dǎo)后植入。植入8周后組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)誘導(dǎo)的MSC/β-TCP復(fù)合物表現(xiàn)出膜內(nèi)成骨的現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)骨髓樣組織；而經(jīng)過(guò)成軟骨誘導(dǎo)的MSC/β-TCP復(fù)合物體外形成了富含Ⅱ型膠原和蛋白多糖的軟骨樣組織，皮下移植后形成了大量的異位骨，通過(guò)原位雜交技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新生骨主要是由供者M(jìn)SC產(chǎn)生，且發(fā)現(xiàn)有來(lái)源于受體鼠的骨髓結(jié)構(gòu)形成。有研究進(jìn)一步證實(shí)了MSC體外成軟骨誘導(dǎo)能促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生[16－17]。Scotti等[18]認(rèn)為MSC向肥大軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是軟骨內(nèi)骨化發(fā)生的一個(gè)必要過(guò)程，在體外將MSC誘導(dǎo)成肥大軟骨細(xì)胞能顯著促進(jìn)其體內(nèi)軟骨內(nèi)骨化過(guò)程。此外，F(xiàn)arrell等[19]認(rèn)為MSC通過(guò)軟骨內(nèi)成骨的方式更有利于新生骨組織的血管化。

MSC體外成骨與成軟骨誘導(dǎo)均可促進(jìn)其體內(nèi)成骨，但是兩種方法成骨效率的比較，仍有待于進(jìn)一步研究。

4 血管化對(duì)MSC成骨性能的影響

在組織工程骨修復(fù)缺損的過(guò)程中，充足的血液供應(yīng)能為骨缺損部位微環(huán)境提供大量的成骨祖細(xì)胞、信號(hào)分子以及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，同時(shí)能帶走代謝廢物與各種降解產(chǎn)物，有助于建立良好的再生微環(huán)境。而MSC支架材料復(fù)合物植入后能否成功地介導(dǎo)骨生成主要取決于MSC的生物學(xué)活性，血液供應(yīng)不足將會(huì)影響其增殖、分化及分泌功能，導(dǎo)致成骨量降低。因此，血管化在MSC成骨過(guò)程中至關(guān)重要。目前主要通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管生成因子以及外科手段血管預(yù)置等方法，來(lái)促進(jìn)MSC成骨過(guò)程中的血管化。

4.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞是目前研究最多的血管生成細(xì)胞，大量的研究報(bào)道顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞能與不同組織來(lái)源的MSC體外共培養(yǎng)生成血管樣結(jié)構(gòu)。Verseijden等[20]將人脂肪MSC與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）以2:8比例進(jìn)行三維共培養(yǎng)，成功地實(shí)現(xiàn)了脂肪MSC支架復(fù)合物體外預(yù)血管化，植入裸鼠皮下明顯提高了新生血管形成的數(shù)量，并且能整合至宿主血管系統(tǒng)。

在人骨髓MSC與HUVECs共培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞不僅能促進(jìn)血管生成，而且能使MSC成骨標(biāo)記物ALP的活性提高4倍以上[21]。Liu等[22]將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與成骨誘導(dǎo)后的人骨髓MSC以1:1進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能顯著增強(qiáng)骨髓MSC的成骨礦化能力。Saleh等發(fā)現(xiàn)，HUVEC條件培養(yǎng)基（HUVEC-CM）能夠顯著提高人骨髓MSC中ALP的表達(dá)水平、礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量以及成骨相關(guān)標(biāo)志基因ALP、BMP-2、ON與OPN的表達(dá)水平，并且在HUVEC與人骨髓MSC三維共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這種成骨促進(jìn)作用，并發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下HUVEC能增強(qiáng)pSmad 1/5/8的表達(dá)水平，激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路，促進(jìn)骨生成。

臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是多數(shù)研究中主要的血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源，然而與宿主的免疫不相容性，使其很難進(jìn)入臨床應(yīng)用。因此，有研究認(rèn)為，自體脂肪組織來(lái)源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞和外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，有可能成為新的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源[23-25]。

4.2 血管生成因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）是兩個(gè)強(qiáng)有力的血管生成促進(jìn)因子[26－27]，對(duì)MSC血管微環(huán)境的形成至關(guān)重要。Huang等[28]在基于骨髓MSC骨組織再生的研究中發(fā)現(xiàn)，加入VEGF后能顯著增加新生血管的生成及骨組織形成量。Singh等[29]將外源性的VEGF結(jié)合至膠原包被的聚已酸內(nèi)酯（PCL）支架，結(jié)果顯示，VEGF對(duì)支架植入后早期血管生成有顯著促進(jìn)作用。VEGF與PDGF不僅能增加新生血管形成而且還能對(duì)MSC的增殖、分化等進(jìn)行調(diào)節(jié)。Alimonte等[30]發(fā)現(xiàn)VEGF能促進(jìn)人牙髓MSC的體外增殖以及成骨分化性能。Caplan等[31]認(rèn)為PDGF一方面通過(guò)增強(qiáng)MSC對(duì)成骨因子BMP等的敏感性來(lái)促進(jìn)MSC成骨分化，另一方面通過(guò)刺激血管周細(xì)胞分泌VEGF來(lái)促進(jìn)血管生成，更可誘導(dǎo)血管周細(xì)胞對(duì)新生血管的再貼附，具有穩(wěn)定新生血管的作用。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）在基于MSC的骨再生過(guò)程中也具有促進(jìn)骨生成及血管化的作用[32－33]。Jiang等[34]用bFGF基因轉(zhuǎn)染的骨髓MSC注入至經(jīng)成骨牽引的新西蘭兔下頜骨牽引間隙中，發(fā)現(xiàn)bFGF轉(zhuǎn)染的骨髓MSC成骨量、骨密度以及骨礦物含量顯著高于對(duì)照組。Chen等[35]認(rèn)為bFGF能增高成骨分化因子及ALP的mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)MSC體內(nèi)成骨量及血管化水平。

VEGF、PDGF及bFGF等血管生成因子在促血管、促成骨方面的作用已經(jīng)得到認(rèn)可，但在應(yīng)用過(guò)程中很難控制釋放的穩(wěn)定性。因此，尋找合適的支架材料來(lái)介導(dǎo)其在特定的時(shí)空內(nèi)穩(wěn)定釋放成為了新的難題。

4.3 血管預(yù)置

為了使組織工程復(fù)合物得到更好的血液供應(yīng)，有研究提出用外科手段進(jìn)行血管預(yù)置，以促進(jìn)血管化進(jìn)程。Cai等[36]以隱靜脈為蒂，使其緊貼于BMSC-珊瑚羥基磷灰石（CHA）支架復(fù)合物表面，以達(dá)到預(yù)血管化目的。手術(shù)植入4周后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMSC-CHA復(fù)合物中形成了規(guī)則的血管網(wǎng)絡(luò)，且前3個(gè)月成骨總量比未血管化組高1倍。Zhao和Kawamura等[37-38]分別使橈動(dòng)靜脈與隱動(dòng)靜脈從BMSC支架復(fù)合物中間穿過(guò)，并將其遠(yuǎn)端結(jié)扎，成功將其預(yù)血管化，并發(fā)現(xiàn)這種血管預(yù)置方法能明顯促進(jìn)支架中血管的長(zhǎng)入，增強(qiáng)骨缺損的修復(fù)效果，提高BMSC支架復(fù)合物ALP的活性及骨鈣素的含量。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，用動(dòng)靜脈環(huán)路的方法預(yù)置血管，也能增強(qiáng)組織工程復(fù)合物中血管的長(zhǎng)入，提高M(jìn)SC最終的成骨效果[39]。

血管預(yù)置的方法能明顯促進(jìn)組織工程血管化及骨組織的生成，對(duì)臨床大面積骨缺損的修復(fù)意義重大。各種血管預(yù)置的方法，如動(dòng)靜脈束、動(dòng)靜脈束末端結(jié)扎、動(dòng)靜脈環(huán)路等均具有促血管生成的作用，但提高M(jìn)SC成骨性能及骨缺損修復(fù)能力仍有待進(jìn)一步探討。

MSC是骨缺損修復(fù)中重要的種子細(xì)胞，骨缺損治療的最終效果由影響MSC成骨的各種因素共同決定。根據(jù)需求選擇最佳種子細(xì)胞來(lái)源、優(yōu)化的MSC分離純化方式、恰當(dāng)?shù)捏w外擴(kuò)增及誘導(dǎo)方案，以及體外、體內(nèi)血管化的建立和維持等均會(huì)影響MSC最終的成骨效果。

未來(lái)的研究方向主要有探索具備優(yōu)良成骨性能MSC亞群的特異性標(biāo)志物、建立高效純化的分離方式、綜合利用影響MSC成骨性能的各種因素模擬其成骨發(fā)育微環(huán)境，使之充分發(fā)揮自身的成骨性能，為提高臨床基于MSC的骨缺損治療效果提供理論基礎(chǔ)及優(yōu)化方案。

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Influence Factors on Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells

XIE Fangnan,KANG Ning,XIAO Ran.Research Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.

XIAO Ran(E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn).

Mesenchymal stem cell;Tissue engineering;Cell source;Isolation and purification;Induction strategy;Vascularization

Q813.1+2

B

1673－0364（2012）04－0225－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.013

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30871433，31071305）。

100144 北京市 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科研究所。

肖苒（E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn）。

【Summary】Mesenchymal stem cell(MSC)has broad prospects in the field of regenerative medicine and tissue engineering due to its highly self-renewal and multi-lineage differentiation ability.Although there are many researches about MSC osteogenic differentiation,its osteogenic efficiency is still very low both in vitro and in vivo.Therefore,how to improve the MSC osteogenic performance has become the focus of researchers.MSC osteogenic performance is influenced by many factors.In this review,the influence factors are discussed from four aspects:cell sources,approaches of isolation and purification,induction strategies and vascularization.

2012年5月29日；

2012年7月2日）