許益聘 綜述 葉信海 審校

視神經損傷是眼外傷最嚴重的后果之一，在眼外傷中占較大的比例。急性視神經損傷在臨床較為常見，如果缺乏及時有效的救治，半數患者最終將喪失視力[1]。視神經損傷后，視功能的恢復程度主要取決于視網膜節(jié)細胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的存活數量和軸突的再生情況[2]。視神經損傷后的修復再生是一個復雜的生理生化過程，機制尚未明確。因此，如何最大限度地修復患者損傷的視神經，以期達到功能重建，提高患者的生存質量，對恢復患者正常的工作、生活具有重要意義。尋找促進視神經再生和修復的有效方法已成為現代神經生物領域的研究熱點，研究發(fā)現mTOR信號通路的表達對視神經再生有重要作用。

1 mTOR的結構

雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是1991年Heitman等[3]在分析雷帕霉素對不同酵母菌的作用時發(fā)現的，廣泛存在于哺乳動物中，進化十分保守。人的mTOR基因位于染色體1p36.2上，其mRNA翻譯后的蛋白質有2549個氨基酸殘基，分子質量為289 KD。mTOR的結構域從氨基端到羧基端依次為HEAT重復序列、FAT結構域、FRB激酶結構域、NRD及FATC結構域?？拷黰TOR的C端有一個激酶結構域，約234個氨基酸殘基，其結構和磷脂酰肌醇3-激酶(PIKK)的催化域相似，是mTOR屬于PIKK蛋白激酶類家族的重要原因之一。緊挨著激酶結構域上游的是FRB（FKBP12-rapamycin binding）結構域，它是 FKBP12-rapamycin復合物的結合位點，在雷帕霉素特異性抑制mTOR中起著連接作用。雷帕霉素可與細胞內的受體FKBP12結合形成FKBP-rapamycin復合物，再與mTOR的FRB區(qū)相結合，從而抑制mTOR的激酶活性[4]。

2 mTOR信號傳導途徑

2.1 上游信號傳導途徑

mTOR的上游信號傳導主要通過PI3K/Akt/mTOR途徑和非依賴PI3K/Akt途徑，以實現對細胞生長、細胞周期等多種生理功能的調控。

2.1.1 經典信號傳導途徑—PI3K/Akt/mTOR信號通路

活化的磷酸肌醇 3激酶 （Phosphoinositide 3-kinases，PI3K）能磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸鹽（Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate，PIP2）并轉變?yōu)榱字＜〈既姿猁}（Phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate，PIP3）。后兩者仍然位于細胞膜，并召集下游分子Akt到細胞膜上。PIP3可以召集并激活磷脂酰肌醇依賴性激酶-1（Phosphatidylinositol-dependent kinase 1/2，PDK-1），從而使 Akt磷酸化并激活[5]。 另外，PTEN對 PI3K有反饋調節(jié)作用，催化PIP3轉化為PIP2，從而負調節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性[6]。因此，PTEN的失活能促使PIP2轉化為PIP3，激活Akt和mTOR。

正常情況下，結節(jié)性腦硬化復合物-1（TSC-1）和TSC-2形成二聚體復合物，是小GTP酶Rheb（Rashomolog enriched in brain）的抑制劑，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情況下抑制mTOR的功能。當Akt活化后，可磷酸化TSC-2而抑制TSC-1/TSC-2復合物的形成，從而解除了對Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活[7]。

2.1.2 非依賴 PI3K/Akt途徑

研究發(fā)現，AMPK（AMP-activated protein kinase A）與mTOR的活性調節(jié)有關。在哺乳動物細胞系中，氨基酸的代謝調節(jié)不是通過PI3K/Akt/mTOR通路來實現的，而是直接通過LKB1/AMPK/mTOR通路來調節(jié)。在細胞中，當ATP/ADP比率下降時，AMP的水平變化比ATP的變化更為敏感。AMPK則對細胞內非常細微的AMP濃度變化十分敏感[8]。在缺乏能量的細胞內，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活性，促進TSC-1/TSC-2復合物形成，抑制Rheb酶活性，從而間接抑制mTOR通路的活性[9]。AMPK在能量壓力下還可以直接磷酸化mTOR[10]。

2.2 下游效應器

真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白（4E-BP）和p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）是mTOR下游最具特色的兩個效應器，形成了平行調節(jié)mRNA轉譯的兩條信號通路。

4EBP1（eIF4E-binding protein 1）的 mRNA中含有從DNA中轉錄得到的遺傳信息，是蛋白質生物合成的模板。在真核生物蛋白質合成的起始階段，由于5’端mRNA的特殊帽狀結構，核糖體不能直接與mRNA相結合，而是需要翻譯起始因子的幫助。eIF-4E又稱為帽結合蛋白（Cap-binding protein，CBP），它與mRNA的5’帽結構結合后再與eIF-4G結合，eIF-4G作為一種支架蛋白募集eIF-4A形成三聚體復合物eIF-4F，而此復合物可以使核糖體結合到mRNA上從而起始蛋白質的翻譯。4EBP1有同eIF-4G相似的eIF-4E識別序列，故4EBP1、eIF-4G與eIF-4E的結合存在部分重疊，4EBP1可以通過競爭性抑制eIF-4G與eIF-4E的結合來達到抑制翻譯起始的作用。mTOR信號通路通過磷酸化4EBP1，使eIF-4E與其解離并活化，促使翻譯起始復合物的形成，從而加速蛋白質的合成。相反，當生長因子或營養(yǎng)素缺乏，或者有mTOR抑制物存在時，4EBP1去磷酸化，并與eIF-4E結合從而抑制翻譯起始[11]。

p70S6K是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，可激活S6；而 S6可以提高含 5’-TOR（5'-terminal oligopyrimidine tract）的一類mRNA的翻譯效率。這類5’-TOR mRNA約占總mRNA的20%，它的翻譯產物包括許多翻譯元件成分如核糖體蛋白、延伸因子EF1ɑ等。mTOR可以磷酸化并激活S6K1，使核糖體40S小亞基易于結合翻譯復合物，并提高5’-TOR mRNA的翻譯效率[12]。

3 mTOR信號通路與視神經再生的關系

成年哺乳動物的中樞神經系統損傷后，神經元不會再生。這是因為中樞神經細胞外環(huán)境中的抑制因子和成熟CNS再生能力的減弱[13-16]。隨著細胞外抑制因子的清除，損傷部位周圍只能出現一定量的軸突再生[17-19]。而細胞內在的再生能力對軸突再生起著決定性作用。在哺乳動物發(fā)育期過后，大部分的成熟神經細胞常表達一些抑制細胞生長的因子[20]。有研究通過向成年小鼠玻璃體腔內注射表達腺病毒的方法敲除特異性基因，來觀察細胞因子對視神經再生的影響，其中包括 Rb、P53[21]、Smad4[22]、Dicer[23]、LKB1[24]和 PTEN[25]。 在注射病毒2周后，制造視神經擠壓傷，觀察損傷后視網膜節(jié)細胞（Retinal ganglion neurons，RGCs）存活數目及軸突再生情況。結果顯示，PTEN的敲除能使RGCs存活數目增多，并且在損傷14 d后能觀察到RGCs軸突纖維有較長距離的再生。損傷2周后敲除PTEN的RGCs的存活數目為45%，與對照組的20%相比有明顯增多。8%～10%RGCs的軸突向損傷中心生長長度超過了0.5 mm，部分甚至超過3 mm。這些再生神經纖維能沿著視神經繼續(xù)生長，在損傷4周后能延伸到視交叉。在其他敲除基因中，只有p53的敲除能誘導增加RGCs存活數目，但并沒有出現軸突纖維再生。從而可以看出RGCs的存活數目的增多并不一定會同時出現視神經再生[26]。

PTEN的敲除能激活PI3k/mTOR信號通路，然后該信號通路通過調節(jié)蛋白質的合成從而控制細胞的生長和大小。mTOR的下游傳導途徑主要為核糖體S6激酶1(S6K1)和4EBP1。S6K1的功能是磷酸化核糖體蛋白S6(p-S6)，故可以利用p-S6的抗體來監(jiān)測mTOR信號通路活化。在胚胎時期的神經元細胞中可觀察到高水平表達的p-S6，但在90%的成熟RGCs中p-S6表達明顯減少。這證明大部分成熟RGCs的mTOR信號通路是處于失活狀態(tài)的，只有少部分RGCs保留著mTOR通路的活化。然而當視神經軸突斷裂損傷后，RGCs的p-S6完全被抑制，表明視神經損傷可進一步抑制mTOR通路的激活。這不僅僅與損傷直接相關，也與損傷后的缺氧狀態(tài)及Redd1/2信號的上調等因素相關[26-29]。

成年小鼠在PTEN基因敲除的誘導作用下，視神經RGCs的p-S6表達水平未見提高，然而遭受視神經擠壓損傷后可觀察到與未損傷時相接近的p-S6表達水平。盡管軸突經歷了損傷的應激反應，敲除PTEN的神經元仍能保持與未損傷時相接近的mTOR激活比例，并且出現軸突再生的RGCs數目比例與未損傷時相接近。

在PTEN敲除誘導成熟RGCs軸突再生作用中，mTOR通路的活化也是非常必要的。通過抑制mTOR通路的激活來觀察軸突再生情況的實驗顯示，隨著mTOR的抑制劑雷帕霉素的應用，RGCs內的p-S6水平明顯降低，抵消了神經元的存活數目增多及軸突再生，證明了mTOR在敲除PTEN后出現的視神經再生中起到關鍵作用。但仍能觀察到少量的軸突再生纖維，這可能與PTEN的其他下游傳導途徑相關。

mTOR的另一個負調節(jié)通道TSC1/2能抑制mTOR的激活，但TSC1或TSC2中任一個缺失都將導致mTOR通路的激活[30-32]。在敲除TSC1的成年RGCs遭受視神經損傷后，RGCs的p-S6水平提高，并且RGC存活數目明顯增多。最重要的是，敲除TSC1的視神經中觀察到相應的軸突再生，但軸突的再生程度比起敲除PTEN所誘導的要弱一些。而對照組未見到軸突再生。因此，mTOR信號通路能有效地促進RGCs的存活及軸突再生。

綜上所述，mTOR信號通路及所調控的蛋白質翻譯在視神經損傷后的軸突再生中起到重要作用。在成熟神經元損傷后，mTOR信號通路處于失活狀態(tài)，并抑制了軸突再生所需蛋白質的合成。通過敲除PTEN或TSC1基因的方法可誘導軸突再生所需的蛋白質合成，從而促進RGCs軸突再生。但現有的研究尚處于初步階段，其具體的信號轉導調節(jié)機制及與視神經再生發(fā)生機制更詳細的關系還有待深入研究。

[1]Hsieh CH,Kuo YR,Hung HC,et al.Indirect traumatic optic neuropathy complicated with periorbital facial bone fracture[J].Trauma,2004,56(4):755-801.

[2]Carta A,Ferrigno L,Salvo M,el al.Visual prognosis after indirect traumatic optic neuropathy[J].J Neurol Neurosurg Psychiartry,2003,74(2):246-248.

[3]Heitman J,Movva NR,Hall MN.Tagets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast[J].Seinece,1991,253(5022):905-909.

[4]Jacinto E,Hall MN.TOR signaling in bugs,brain and brawn[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(2):117-126.

[5]Song G,Ouyang G,Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[J].J Cell Mol Med,2005,9(1),59-71.

[6]Adjei AA,Hidalgo M.Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy[J].J Clin Oncol,2005,23(23):5386-5403.

[7]Vignot S,Faivre S,Aguirre D,et al.mTOR-targeted therapy of cancer with rapamycin derivatives[J].Ann Oncol,2005,16(4):525-537.

[8]Hay N,Sonenberg N.Upstream and downstream of mTOR[J].Genes Dev,2004,18(16):1926-1945.

[9]Rutter GA,Da Silva Xavier G,Leclerc I.Roles of 5’-AMP-activated protein kinase(AMPK)in mammalian glucose homoeostasis[J].Biochem J,2003,375(1):1-16.

[10]Inoki K,Zhu T,Guan KL.TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival[J].Cell,2003,115(5):577-590.

[11]Cheng SW,Fryer LG,Carling D,et al.Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin(mTOR)phosphofylation site regulated by nutrient status[J].J Biol Chem,2004,279(16):15719-15722.

[12]Heesom KJ,Denton RM.Dissociation of the eukaryotic initiation factor-4E/4E-BP1 complex involves phosphorylation of 4E-BP1 by an mTOR-associated kinase[J].FEBS Lett,1999,457(3):489-493.

[13]Schwab ME,Bartholdi D.Degeneration and regeneration of axons in the lesioned spinal cordPhysiol[J].Physiol Rev,1996,76(2):319-370.

[14]Goldberg JL,Klassen MP,Hua Y,et al.Amacrine-signaled loss of intrinsic axon growth ability by retinal ganglion cells[J].Science,2002,296(5574):1860-1864.

[15]Filbin MT.Recapitulate development to promote axonal regeneration:good or bad approach[J]?Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2006,29,361(1473):1565-1574.

[16]Fitch MT,Silver J.CNS injury,glial scars,and inflammation:inhibitory extracellular matrices and regeneration failure[J].Exp Neurol,2008,209(2):294-301.

[17]Case LC,Tessier-Lavigne M.Regeneration of the adult central nervous system[J].Curr Biol,2005,15(18):R749-R753.

[18]Yiu G,He Z.Glial inhibition of CNS axon regeneration[J].Nat Rev Neurosci,2006,7(8):617-627.

[19]Harel NY,Strittmatter SM.Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury[J]?Nat Rev Neurosci,2006,7(8):603-616.

[20]Weinberg RA.The biology of gancer[M].London:Garland Science,2007:209-253.

[21]Marino S,Vooijs M,van Der Gulden H,et al.Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum[J].Genes Dev,2000,14(8):994-1004.

[22]Yang X,Li C,Herrera PL,et al.Generation of Smad4/Dpc4 conditional knockout mice[J].Genesis,2002,32(2):80-81.

[23]Harfe BD,McManus MT,Mansfield JH,et al.The RNase III enzyme dicer is required for morphogenesis but not patterning of the vertebrate limb[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(31):10898-10903.

[24]Bardeesy N,Sinha M,Hezel AF,et al.Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation[J].Nature,2002,419(6903):162-167.

[25]Groszer M,Erickso R,Scripture-Adams DD,et al.Negative regulation of neural stem/progenitor cell proliferation by the Pten tumor suppressor gene in vivo[J].Science,2001,294(5549):2186-2189.

[26]Goldberg JL,Espinosa JS,Xu Y,et al.Retinal ganglion cells do not extend axons by default:promotion by neurotrophic signaling and electrical activity[J].Neuron,2002,33(5):689-702.

[27]Brugarolas J,Lei K,Hurley RL,et al.Regulation of mTOR function in response to hypoxia by REDD1 and the TSC1/TSC2 tumor suppressor complex[J].Genes Dev,2004,18(23):2893-2904.

[28]Corradetti MN,Inoki K,Guan KL.The stress-inducted proteins RTP801 and RTP801L are negative regulators of the mammalian target of rapamycin pathway[J].J Biol Chem,2005,280(11):9769-9772.

[29]Reiling JH,Hafen E.The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of TSC in Drosophila[J].Genes Dev,2004,18(23):2879-2892.

[30]Garami A,Zwartkruis FJ,Nobukuni T,et al.Insulin activation of Rheb,a mediator of mTOR/S6K/4E-BP signaling,is inhibited by TSC1 and 2[J].Mol Cell,2003,11(6):1457-1466.

[31]Inoki K,Zhu T,Guan KL.TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival[J].Cell,2003,115(5):577-590.

[32]Tee AR,Manning BD,Roux PP,et al.Tuberous sclerosis complex gene products,Tuberin and Hamartin,control mTOR signaling by acting as a GTPase-activating protein complex toward Rheb[J].Curr Biol,2003,13(15):1259-1268.