李 榮,郁 迪,楊最素,王加斌,李 麗,丁國芳
(1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點工程技術(shù)研究中心,浙江舟山 316004;2.浙江海力生集團(tuán)有限公司,浙江舟山 316021;3.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江舟山 316021)
寡肽(Oligo-peptide)是由2~10個氨基酸組合而成的蛋白質(zhì)前體,或是由蛋白質(zhì)降解到2~10個氨基酸形成的一種低分子量生物活性肽,也稱小肽、短肽等。獨特的氨基酸組成,使寡肽可直接被人體完整的吸收,且比氨基酸更容易消化吸收,營養(yǎng)和生理效果也更為優(yōu)越[1]。我國海洋生物資源豐富,海洋動物種類繁多,其中大部分蘊含豐富的蛋白質(zhì)及肽,由于海洋動物處于高鹽、高壓、低溫缺氧、光照不足等特殊的生活環(huán)境中,使得來源于海洋動物的蛋白質(zhì)和肽具有獨特的生物活性。如今,已有研究表明海洋動物寡肽具有抗氧化,抗腫瘤,抗高血壓,降血糖,增強機(jī)體免疫力等活性,并已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥,功能食品,化妝品等多個領(lǐng)域。本文主要根據(jù)海洋動物寡肽的來源將其分為幾大類,并對各類寡肽的制備方法及其生物活性進(jìn)行綜述。
魚類是人們最早食用的海洋動物之一,營養(yǎng)價值極高,體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)。RIM等[2]在蝦虎魚肌肉蛋白酶解物中利用Sephadex G-25和RP-HPLC等實驗技術(shù)分離出幾種具有抗凝血作用的小肽,這些小肽具有延長凝血酶時間和活化部分凝血酶時間的作用,氨基酸序列分別為:Leu-Cys-Arg,His-Cys-Phe,Cys-Leu-Cys-Arg和Leu-Cys-Arg-Arg。已有研究表明在長喙鮭魚Hypoptychus Dybowskii[3]、太平洋鱈魚Merluccius productus[4]、紅鯛魚Lutjanus vitta[5]及金槍魚[6]的肉組織蛋白酶解物中也分離得到強抗氧化活性短肽。說明這些海洋魚類蛋白酶解得到的寡肽是很好的天然抗氧化物的來源。
在海洋食品工廠化生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量的下腳料如魚蝦類內(nèi)臟等,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這些下腳料中含有大量活性物質(zhì),根據(jù)其活性進(jìn)一步開發(fā)利用,可提高下腳料的經(jīng)濟(jì)價值。ALI等[7]利用沙丁魚Sardinella aurita的頭及內(nèi)臟等廢棄物作為實驗原料,采用酶解法進(jìn)行提取,通過Sephadex G-25和RP-HPLC進(jìn)一步分離純化后得到七種新型抗氧化活性寡肽其氨基酸結(jié)構(gòu)分別為Leu-His-Tyr、Leu-Ala-Arg-Leu、Gly-Gly-Glu、Gly-Ala-His、Gly-Ala-Trp-Ala、Pro-His-Tyr-Leu 和 Gly-Ala-Leu-Ala-Ala-His。DPPH 自由基清除實驗,抑制亞油酸自氧化實驗及還原力測試表明這些活性肽有較強的抗氧化活性,其中Leu-His-Tyr的自由基清除能力最強,在150 μg/mL時對DPPH自由基的清除率可達(dá)到63%±1.5%。KUMAR等[8]在體外模擬胃腸的消化作用,對竹莢魚Magalaspis cordyla內(nèi)臟進(jìn)行處理得到其蛋白水解物,再利用FPLC,DEAE陰離子交換技術(shù),Sephadex G-25等方法對樣品進(jìn)行分離純化,最終得到一種具有強抗氧化活性的寡肽,經(jīng)ESI-MS/MS分析確定其氨基酸序列為:Ala-Cys-Phe-Leu(518.5 Da),抗氧化活性測定結(jié)果表明該活性肽對DPPH和羥自由基的清除率分別可達(dá)到89.2%和59.1%,并且抑制多不飽和脂肪酸氧化的能力要強于天然抗氧化劑 α-tocopherol。
膠原蛋白(Collagen)又稱膠原,是真皮的主要組成成分。由于膠原蛋白分子是由3條多肽鏈構(gòu)成3股螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),能維持皮膚張力和彈性,和周圍組織的親合性好,具有修復(fù)組織的作用,且分子中含有大量的酰胺基團(tuán)和羥基,具有較強的吸濕性,從而使皮膚保持飽滿充盈[9]。楊國艷等[10]對膠原三肽的抗氧化活性進(jìn)行了研究,并與普通膠原蛋白肽進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)不論是在體外實驗中對DPPH自由基、螯合Fe2+的清除能力還是小鼠體內(nèi)實驗中提高SOD活力,降低MDA含量的能力,膠原三肽均優(yōu)于普通膠原蛋白肽。在魚皮和魚鰾中含有大量膠原蛋白,利用酶解法等對這些膠原蛋白處理可得到更易于人體吸收的膠原蛋白肽。賈建萍等[11]對三文魚Oncorhynchus keta皮膠原蛋白肽的制備及其抗氧化活性進(jìn)行了研究,經(jīng)過提取分離純化得到了不同分子量區(qū)間的活性肽,發(fā)現(xiàn)當(dāng)分子量在180~1 000 Da的活性肽含量越高時,抗氧化活性越好。ZHU等[12]對鮭魚Salmo salar皮寡肽作用于二型糖尿病大鼠模型所產(chǎn)生的功效進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)鮭魚皮寡肽作用于大鼠模型后可減少其體內(nèi)FBG水平和胰島細(xì)胞的凋亡頻率,降低大鼠胰島中Fas的表達(dá),并且使大鼠血清中TNFα,IFNγ和MDA的水平顯著降低。段振華等[13]對超聲波輔助魚鰾寡肽制備工藝進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)超聲波處理30 min可以最大程度地促進(jìn)魚鰾蛋白的水解,解效果在固液比1:35時最好,正交試驗確定魚鰾蛋白最佳酶解條件為溫度55℃,pH值6.0,酶量0.8%,反應(yīng)時間7 h,此時的平均肽鏈長度約為5.6,表明實驗所得的膠原蛋白肽為寡肽。韓鳳杰等[14]采用酶解法在比目魚Pleuronectiformes皮中提取得到分子量分布在0.6~1.8 kDa的比目魚皮膠原肽,對其活性測定發(fā)現(xiàn)比目魚皮膠原寡肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)有明顯的抑制作用,IC50可達(dá)1.65 mg/mL。且分子量越小的組分的抑制效果越好。小鼠動物試驗還表明無論內(nèi)服或外用,該膠原蛋白寡肽均能促進(jìn)皮膚內(nèi)膠原的合成,表明可起到美容和保健的功能。
國內(nèi)外學(xué)者已對鯊魚進(jìn)行了較廣泛的研究,其中包括對鯊魚中活性肽的大量研究。呂正兵等[15]從鯊魚肝臟中首次分離純化獲得了鯊肝活性肽(shark hepatic active peptide,SHAP),并用流式細(xì)胞儀分析了SHAP對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠細(xì)胞凋亡的影響。實驗顯示以3 mg/kg SHAP進(jìn)行保護(hù)可使細(xì)胞凋亡率下降至3.24%±1.62%。表明肝鯊活性肽具有保護(hù)肝細(xì)胞的生理活性。黃鳳杰等[16]發(fā)現(xiàn)鯊魚肝活性肽S28300對鏈佐霉素和四氧嘧啶所致的血糖升高有顯著的抑制作用,這表明鯊魚肝活性肽S28300可能具有減弱STZ對胰島β細(xì)胞的殺傷作用或改善損傷的胰島β細(xì)胞的功能。謝宗法等[17]采用現(xiàn)代生物技術(shù)從幼年鯊魚肝臟中提取出一組小分子多肽物質(zhì),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞等多種組織細(xì)胞的增殖分化,提高人淋巴細(xì)胞形成Ea花環(huán)的能力,誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN-γ,增強NK細(xì)胞活性,對淋巴細(xì)胞表面HLADR抗原的表達(dá)也顯示出良好的正向調(diào)節(jié)作用。WU等[18]從芽孢桿菌中提取蛋白酶SM98011,用其水解鯊魚肉后純化得到7個具有高效抑制ACE的2肽,它們的氨基酸序列分別為:Cys-Phe、Glu-Tyr、Met-Phe、Phe-Glu、Cys-Phe、Glu-Tyr和 Phe-Glu。
頭足類動物(如烏賊、魷魚、章魚)中含有許多肽類活性物質(zhì)。其神經(jīng)末梢含有肽能激素,如軟體動物心肌肽FMPF、利鈉肽免疫反應(yīng)物質(zhì)。IWAKOSHI等[19]從日本章魚Octopus minor腦提取液中得到2個活性寡肽Ocp-1:Gly-d-Phe-Gly-Asp和Ocp-3:Gly-Ser-Trp-Asp,并證明它們作為神經(jīng)肽/神經(jīng)激素參與心血管系統(tǒng)的刺激性調(diào)控。RAJAPAKSE等[20]利用超濾法在大王烏賊Dosidicus gigas肌肉蛋白中分離得到小分子量的肽,研究發(fā)現(xiàn)其中氨基酸序列為Asn-Gly-Leu-Glu-Gly-Leu-Lys(747 Da)的小肽具有強抗氧化活性,對亞油酸氧化反應(yīng)有明顯抑制作用,且抗氧化能力與人工合成抗氧化劑丁羥甲苯的活性相當(dāng),在電子自旋捕捉的研究中發(fā)現(xiàn),這種活性肽對羥自由基的IC50為428.54 μM;對超氧自由基的IC50為573.83 μM。PAVLINA等[21]利用超濾,RP-HPLC等實驗手段,在紅螺Rapana venosa血淋巴中分離出11種分子量在3 000~9 500 Da的新型富含脯氨酸的小肽,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中4種小肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較高的抑菌活性。丁國芳等[22]從烏賊墨中通過酶解得到一種寡肽,其具有明顯的抗腫瘤作用。謝超等[23]對魷魚肝臟蛋白酶解物進(jìn)行提取分離得到一種ACE抑制肽,抑制活性最高組分的IC50為1.80 mg/mL,這種具有高ACE抑制活性的抑制肽可進(jìn)一步研究并將其開發(fā)為相關(guān)藥物或功能食品。
貝類,屬軟體動物門中的瓣鰓綱,常見的牡蠣、貽貝、蛤、蟶等都屬此類。
WANG等[24]利用葡聚糖凝膠LH-20和RP-HPLC等試驗方法對牡蠣Crassostrea talienwhanensis酶解物進(jìn)行分離純化,得到具有ACE抑制活性的九肽,其氨基酸序列為Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe。自發(fā)性高血壓小鼠體內(nèi)實驗表明,該活性肽具有良好的抗高血壓活性。楊永芳[25]等利用酶解等方法在菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum中提取得到分子量為607.6 kDa,氨基酸序列為:Asp-Trp-Pro-His的抗氧話活性寡肽。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在在櫛孔扇貝[26]、扇貝Chlamys farreri裙邊[27],牡蠣Ostrea rivularis[28]、文蛤[29]的酶解液中也都提取得到分子量小于1 000 Da的抗氧化活性肽。楊永芳等[30]在貽貝Mytilus coruscus水解液中分離出一種氨基酸序列為Asp-Leu-Tyr的寡肽,并利用MTT法,免疫組化法,及流式細(xì)胞儀檢測等實驗方法檢測該寡肽的體外抗腫瘤活性,結(jié)果表明該寡肽具有良好的抗腫瘤活性。
高F值寡肽是一類由3~7個氨基酸殘基組成的混合小肽體系,含有高支鏈氨基酸和低芳香族氨基酸的特殊生物活性肽,具有輔助治療肝性腦病、改善肝昏迷程度和精神狀態(tài)的功能,對于酒精、藥物等引起的急慢性肝損傷也起到了積極的保肝護(hù)肝作用[31]。周敏華等[32]利用活性碳吸附法對牡蠣Ostrea rivularis酶解液進(jìn)行吸附分離,酶解產(chǎn)物采用活性碳吸附后,再經(jīng)過Biogel P2凝膠層析進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化,得到相對分子質(zhì)量約800~1 450,F(xiàn)值大于20的高F值寡肽混合物。鄭惠娜等[33]對馬氏珠貝母Pinctada martensii高F值寡肽的抗氧化作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其對羥自由基、DPPH自由基及超氧陰離子均有一定的清除能力。并且發(fā)現(xiàn)其對H2O2誘導(dǎo)的LO2肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。
海綿(Sponge)是最低等的多細(xì)胞動物,結(jié)構(gòu)較簡單,但含有極為豐富的生理活性物質(zhì)。Euryjanicin A是從加勒比海海綿Prosuberites laughlini中分離得到的一種新型環(huán)狀庚肽。通過X射線晶體學(xué)確定其結(jié)構(gòu)并利用Marfey的方法確定每個氨基酸殘基的絕對構(gòu)型。體外實驗證明其具有抗腫瘤活性[34]。Hemiasterlin最初是由Kashman's小組從南非海域的海綿(hemiasterlin minor)中提取分離的一種具有高修飾的氨基酸三肽分子的天然產(chǎn)物,隨后又在海綿(Cymbastela sp、Siphonchalina spp、Auletta sp)中也提取到此化合物。研究發(fā)現(xiàn)它能結(jié)合長春堿屬作用的微管位點,破壞正常微管的動力學(xué),從而解聚微管,是強有力的抗腫瘤劑[35]。PETTIT[36]從海綿Phakellia sp中分離到的新型環(huán)七肽Phakellistatin14具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性,其對小鼠的淋巴癌細(xì)胞P388的ED50為5 mg/mL。易楊華等[37]從棕色扁海綿Phakellia fusca Thiele的乙醇提取物中獲得1個新的Phakellistatins類環(huán)肽化合物,為1個環(huán)狀七肽(Pro1-Gly-Phe-Pro2-Trp-Leu-Thr),該化合物具有抗腫瘤活性,這些活性成分為今后藥用資源的開發(fā)和新藥研究奠定了基礎(chǔ)。
霞水母學(xué)名Cyanea,屬刺胞動物門,缽水母綱。林丹等[38]對霞水母膠原蛋白活性肽和寡肽膠原的抗疲勞作用進(jìn)行了研究。小鼠負(fù)重游泳試驗、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸含量測定表明兩種受試物各劑量組小鼠的游泳時間明顯長于對照組(P<0.05或P<0.01),運動后血清尿素氮含量及乳酸曲線下面積均低于對照組(P<0.01),游泳后肝糖原含量和空白對照組比較均有不同程度的提高。表明霞水母膠原蛋白活性肽和寡肽膠原均能改善機(jī)體能量代謝,加速肝糖原分解供能,減少蛋白質(zhì)和含氮化合物分解,從而降低血尿素氮,具有抗疲勞作用。
呂傳萍等[39]對南極磷蝦酶解寡肽提取工藝進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取條件為:溫度50.7℃、pH 8.01、加酶量3 010 U/g、時間239 min時,南極磷蝦肽的得率最高,為73.02%,短肽的平均肽鏈長為2.36,平均相對分子量為277.9。范建鳳等[40]酶解梭子蟹下腳料并分離純化得到不同分子量組分的活性肽,發(fā)現(xiàn)分子量在1 000 Da左右的活性肽抗氧化活性最好。謝海偉等[41]對鱟中提取的抗菌肽的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其在120℃、pH小于11.30時,對大腸桿菌K88的MIC為1.52~5.00 mg/L表明,該抗菌肽具有較強的高溫耐受性,并發(fā)現(xiàn)其對胃蛋白酶有較高的穩(wěn)定性。
我國海洋動物資源豐富,種類繁多,蘊含著大量的活性物質(zhì)。目前,已有研究表明海洋動物寡肽擁有多種顯著生物活性,如強抗氧化活性,抗腫瘤活性等,將這些具有顯著生物活性的物質(zhì)開發(fā)為相關(guān)保健食品與藥品已成為研究新熱點,這對海洋活性物質(zhì)的今后研究開發(fā)起到了良好的推進(jìn)作用。
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浙江海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2012年4期