焦延鵬，李立華，羅丙紅，周長忍

(暨南大學材料科學與工程系，廣東 廣州510632)

殼聚糖對骨組織工程中組織修復的影響

焦延鵬，李立華，羅丙紅，周長忍

(暨南大學材料科學與工程系，廣東 廣州510632)

材料植入體內必然引起宿主體的應答，促進或抑制組織愈合。由于降解材料在體內的降解產物會隨時間而變，產生的宿主體應答就會不同，進而會影響組織的愈合。而促進或抑制組織愈合的機制就成為新型醫(yī)用高分子材料設計和制備的理論基礎。殼聚糖是理想的骨組織修復材料之一，但至今還不清楚殼聚糖體內不同降解過程對組織修復的影響機制，也就無法設計出性能優(yōu)良的殼聚糖基新材料。文章沒有羅列殼聚糖基生物材料在骨組織工程中應用所取得的進展，而是重點闡述了殼聚糖在骨組織工程中應用的復雜性和對組織修復的影響，探討了殼聚糖進一步用于骨組織工程所需要解決的問題。

殼聚糖;骨組織工程;組織修復

1 前言

自20世紀80年代提出應用組織工程學概念對組織修復和替換以來，其各項關鍵技術，包括種子細胞、支架材料以及細胞/支架復合體的功能實現(xiàn)等研究，一直是國際上生物學、材料科學、醫(yī)學等眾多學科領域的前沿研究內容。隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展和臨床治療技術的不斷進步，組織再生與構建的研究與應用如雨后春筍，有些結構簡單的組織再生與構建已經進入臨床試用階段。盡管這些簡單的組織替代物已經在臨床治療上發(fā)揮了重要作用，但還遠未達到天然器官或組織的臨床要求，無論在功能還是性能上都相差甚遠。究其原因，既有種子細胞來源及其大規(guī)模培養(yǎng)的問題，也有組織構建和臨床實施的技術問題，但合適的支架材料更是一個至關重要的因素，因為組織的構建或再生以及細胞的功能，都必須依賴于理想的細胞外基質。

骨組織工程是目前生命科學研究最活躍的領域之一，近20年來的研究成果為整形外科、口腔頜面外科、手外科醫(yī)師和廣大患者提供了治療骨缺損的新希望。其基本原理是將體外培養(yǎng)的活組織細胞擴增，種植于生物相容性良好、生物可降解的支架材料上，然后移植到所需部位，在機體內細胞繼續(xù)增殖，隨著支架材料逐漸被降解、吸收，形成新的有功能的組織器官，從而達到修復結構、恢復功能的目的，由此可見支架材料是組織工程成敗的關鍵環(huán)節(jié)之一。圖1給出組織工程各要素的相互關系。

圖1 組織工程各要素的相互關系Fig.1 Relationship among key elements of tissue engineering

在骨組織工程的研究中，原位組織再生與構建的方法很多，但其中最重要的一種方法是將具有生物活性的材料植入缺損位點，利用材料對機體的刺激，促使機體自愈合機制的建立，誘導損傷組織自身分泌特異性細胞因子，并通過系統(tǒng)的信號傳導途徑來激活相應的細胞，借助細胞的轉錄與翻譯功能，依照生物化學和生物物理學的原理，在缺損部位自身“生物合成”形成新的組織。材料在這一過程中不僅僅是扮演了支架的角色，更重要的是作為一種具有生物活性的刺激物來發(fā)揮作用。

2 殼聚糖及其衍生物在骨組織中的應用

2.1 殼聚糖及其衍生物

圖2 殼聚糖的分子結構示意圖Fig.2 Schematic diagram of chitosan molecular structure

殼聚糖是由甲殼素脫乙酰后產生的一種可體內降解吸收的天然生物多糖，是自然界唯一的帶正電的多糖類高分子材料，分子結構如圖2所示。殼聚糖在骨組織修復中的應用，已經受到國內外的廣泛關注，每年有關殼聚糖或甲殼素的論文研究和專利很多［1－3］。國內外的研究已經表明，殼聚糖作為人工皮膚具有促進創(chuàng)傷上皮化，形成肉芽組織，加速傷口愈合的功能［4－5］;作為眼科材料，殼聚糖抑制纖維結締組織，減少疤痕組織形成和促進血管內皮細胞生長的作用［6］，可以用作角膜接觸鏡、粘彈劑、人工淚液、結膜緩釋藥膜等;作為神經導管材料，殼聚糖可以有選擇地抑制成纖維細胞的生長和促進神經膜細胞生長的功能［7－8］;作為骨科材料的研究更是日新月異。自然界中甲殼素的生理功能經常與纖維素相比較，兩者均是在生物復合材料中形成纖維束的胞外多糖。自然界中的甲殼素纖維是包埋在蛋白基質中，蛋白與多糖的結合多以共價鍵形式存在，雖然與多糖結合的蛋白已經能分離和表征，但其中的蛋白質的交聯(lián)程度及多糖－多肽鍵的化學結構還不清楚［9］。

2.2 在骨組織工程中的應用

我國每年由各種原因引起骨損傷、脊柱融合、骨缺損的患者高達一千萬余，其中需使用骨修復材料的約占100萬例，而缺乏理想的骨再生材料一直懸而未決。僅對骨科而言，骨誘導型骨組織修復材料的發(fā)展，將大大推動骨修復材料的應用。骨科臨床上有很多疑難病癥，藥物和其他傳統(tǒng)方法都無能為力，需要應用骨移植、修復或再生。殼聚糖植入體內會引起受主機體各種類型的應答，更重要的是殼聚糖在體內的降解產物又隨植入時間的不同而發(fā)生變化，恰恰就是這些不同時期降解產物的結構、分布和分子量，會影響細胞功能，甚至會對基因轉錄、翻譯，進而對組織愈合有較大地促進或抑制作用。

在損傷骨組織的修復和再生過程中，材料的性能和形態(tài)會影響細胞外基質的性能，進而影響骨組織的修復和再生。骨組織的細胞外基質主要是膠原蛋白、蛋白多糖聚集體、非膠原糖蛋白如骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨粘連蛋白等。鑒于甲殼素在自然界中的存在形式多是與蛋白質結合在一起，人體內的許多糖蛋白也含有氨基葡聚糖結構，所以，殼聚糖植入人體后的各種降解產物均會與蛋白發(fā)生作用，進而與細胞作用后影響骨組織的再生和修復［10－11］。

雖然國際上許多國家已經批準殼聚糖作為植入人體的生物材料，但國內外臨床使用的殼聚糖類植入材料經常出現(xiàn)一些不良現(xiàn)象，其原因有材料的制備加工問題，應用問題以及臨床問題，但最關鍵的是目前的研究主要多集中在對其改性、復合、加工及其一般的生物相容性研究，而對其在體內不同時期的降解產物的組成及其對組織修復過程的影響關注不多，尤其是忽略了降解產物(殼寡糖)及其與蛋白質結合后對細胞功能和性能的影響［12－13］。雖然國內外大量的研究表明:殼聚糖對骨組織修復有一定的促進作用，但殼聚糖體內降解的不同產物對細胞乃至對人體生命的潛在影響尚未研討清晰。

作為骨科修復材料，殼聚糖具有防止組織粘連，預防關節(jié)軟骨退變，并有促進傷口愈合［14］，控制傷口水分損失，抑制外源微生物感染等作用［15］。有研究報道殼聚糖降解生成的單糖被體液磷酸化后，可以轉變?yōu)榧毎饣|的一部分，參與損傷組織的修復［16］。問題是殼聚糖在體內的降解產物不僅僅是單糖參與作用，而是降解過程中產生的各種低聚糖或寡糖都能與蛋白結合或磷酸化，這些不同性能的殼聚糖及其衍生物在體內的作用機制應該系統(tǒng)分析研究，為殼聚糖在體內的廣泛應用提供依據。

3 殼聚糖在骨組織中應用存在的問題

3.1 殼聚糖在組織構建與再生過程的作用復雜

殼聚糖是由氨基葡聚糖和乙酰化氨基葡聚糖2種結構單元通過β-1，4糖苷鍵構成，是一種纖維增強素，負責細胞壁的堅固性，因而作為組織再生或構建的材料，是否會與人體內的細胞發(fā)生作用而影響細胞的功能或活性，尚有待進一步探討。殼聚糖在體內的降解主要是在廣泛存在于人體各種組織和體液中的溶菌酶的作用下完成的，主要的降解產物是(GlcN-GlcNAc)，GlcN和GlcNAc。盡管殼聚糖及其降解產物無抗原性，不會產生抗體，但殼聚糖植入人體后會激活其他免疫系統(tǒng)(如免疫細胞、免疫球蛋白或補體分子等 )而有“異物”反應［17］。

人體內含有許多氨基聚糖，如透明質酸、肝素、硫酸角質素含有N-乙酰氨基葡萄糖等。這些氨基聚糖的糖鏈可通過糖苷鍵共價結合蛋白質，從而形成蛋白聚糖。蛋白聚糖單體又可借非共價鍵與透明質酸結合形成多聚體。氨基糖在體內可與膠原、彈性蛋白、粘連蛋白結合。骨骺中的硫酸軟骨素蛋白聚糖可結合Ca2+，促進鈣化。氨基聚糖(肝素)可與血漿蛋白中的凝血因子結合，具有抗凝作用，肝素還可與脂蛋白脂肪酶結合。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可與FGF(成纖維細胞因子)結合，嵌入質膜中成為跨膜結構，參與細胞－細胞，細胞－基質之間的信息交換等等。

綜上所述，殼聚糖與人體內的細胞外基質的性能都有一定的差別。因此，殼聚糖作為骨組織再生與構建時都有“異物”表現(xiàn)也不足為奇，而產生“異物”的原因及其更深層的問題應該探明［18］。

3.2 殼聚糖對細胞功能的影響及對細胞內通路作用的機制尚不清楚

組織的再生與修復是細胞分裂、分化和自組裝的系統(tǒng)工程，而細胞對胞外環(huán)境產生應答是通過感知某種化學信號和物理刺激，并將其傳遞到細胞核，觸發(fā)或阻遏基因的表達，生產的基因產物最終調節(jié)細胞的分裂、遷移、分化和凋亡。細胞的功能不僅受到胞外基質的影響，也受到機械力的制約，因為機械力會影響細胞的形狀，進而影響細胞對它的信號刺激所做的應答，結果細胞不是生長就是凋亡。對骨組織修復而言，力學刺激對骨細胞、骨髓基質干細胞(MSC)等增殖分化的影響就更加明顯。利用力學裝置加載應力于成骨細胞或MSC，模擬在人體正常生理狀態(tài)時力學環(huán)境，觀察細胞的生物學效應及力學轉導機制是目前研究的熱點之一［19－20］。

在骨組織修復或再生的過程中，材料可通過系統(tǒng)的信號傳導途徑來激活相應的細胞，在缺損部位自身“生物合成”形成新的組織。目前認為力學耦聯(lián)、生化耦聯(lián)、信號傳遞和效應細胞反應，將作用在骨組織的應力信號轉導為生物化學信號。細胞外間質、整合素、局部粘著蛋白和細胞骨架網絡相互聯(lián)系，構成了一個完善的張力整合系統(tǒng)［21－22］。在力學載荷的作用下，由于骨組織細胞的變形，通過細胞外基質和整合素，可導致細胞骨架成分的重組，啟動信號轉導［23］。其中涉及多條信號的轉導，多種蛋白的參與，包括鈣離子通道復合體、G蛋白耦聯(lián)通路、一氧化氮合酶(NOS)、PEG2、磷酸酰肌醇信使系統(tǒng)、MAPK通路等。NF-κB也是參與力學信號轉導的通路之一，不同材料對NF-κB影響的結果不同，即使是相同的材料如殼聚糖，由于其糖基不同，分子量不同，乙?；潭炔煌?，引起NF-κB激活和炎癥發(fā)生的結果也不同。材料的化學性能是否因其所具有的某些特殊的化學基因，使得其可作用于免疫系統(tǒng)，激活細胞內的NF-κB信號通路，現(xiàn)在還不清楚。

成骨細胞是重要的感受與效應細胞，可通過力敏感離子通道、G蛋白與酪氨酸激酶、整合素受體與細胞骨架等多種途徑，感受體內外力學刺激，并將力學刺激信號轉化為細胞生物化學信號，介導力相關敏感基因表達，合成各種酶類等活性物質，激活信號網絡級聯(lián)反應，參與一系列復雜的生理病理活動，因此力學環(huán)境在維持骨組織正常形態(tài)和功能活動中發(fā)揮著重要的影響。目前研究發(fā)現(xiàn):成骨細胞對不同類型的力學刺激有不同的感受和應答機制。成骨細胞在骨的生長發(fā)育及形成過程中起重要作用。成骨細胞的分化時機、分化方向受嚴格控制。這種調控方式是由極其復雜的信號分子與其相連的信號通路實現(xiàn)的。完整、全面地研究和認識成骨細胞分化過程中信號轉導機制，是深入研究成骨細胞分化的條件，同時也是實現(xiàn)骨組織工程化培養(yǎng)的重要基礎。

研究表明，BMP/Smads信號通路及其相關轉錄因子參與成骨細胞分化并在其中發(fā)揮著重要作用［24］。如Rochet等研究表明［25］，在 Cemented中滲加2%的殼聚糖后，破骨細胞對復合生物材料的吸收能力降低，殼聚糖對破骨細胞重吸收活性的抑制作用提示材料植入后的骨形成及骨重塑，說明殼聚糖有利于骨的重建。有研究顯示在骨缺損后各個時段增加殼聚糖降解產物殼寡糖的給藥，BMP-2和TGF-beta的表達明顯高于對照組，使BMP峰值提前，且持續(xù)時間明顯延長。上述結果提示殼寡糖可能通過某種機制使得BMP和TGF-beta在骨折后的修復過程中表達增強，從而使骨折端BMP和TGF-beta的含量增加，增加了間充質細胞向軟骨細胞分化，增強了骨折愈合過程中生長因子與成骨細胞、成軟骨細胞和間充質細胞之間的正反饋調節(jié)，促進骨折端骨質形成，從而加快了骨折的修復及愈合過程。研究表明，殼寡糖能促進成骨細胞增殖，500 mg/L為最適質量濃度，且殼寡糖的效果優(yōu)于氨基葡萄糖和羧甲基殼寡糖。殼寡糖對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨組織微觀結構的保護作用也有報道，殼寡糖可通過促進成骨細胞的體外增殖，通過增加Ca，Mg等礦物元素在骨骼中的沉積率提高去除卵巢大鼠股骨的骨強度，從而顯著提高絕經后骨質疏松癥模型動物股骨干骺端的骨礦物質密度［26］。

最近有報道指出，骨髓基質干細胞在殼寡糖膜上生長良好且可在外界誘導下向骨細胞分化［21］。殼聚糖及其降解產物促進成骨細胞分化的機制可能有以下幾點:①可能是通過某種機制使得一些細胞因子如BMP表達上調，從而使得BMP/Smads信號通路激活，增加間充質細胞向骨組織細胞的分化;②殼寡糖可通過內吞作用進入到細胞漿或細胞核內，與細胞內的相關物質作用，通過直接或間接作用影響B(tài)MP/Smads通路;③殼寡糖通過與胞膜受體結合，啟動BMP/Smads信號通路，從而影響了下游基因表達。

4 結語

殼聚糖除了能夠較好地調節(jié)合成材料的降解產物的酸性之外，在細胞培養(yǎng)和動物試驗中，發(fā)現(xiàn)殼聚糖與成骨細胞具有良好的相容性，并能夠促進成骨細胞的增殖與分化，是一類有著巨大應用前景的骨組織修復材料，但問題是，尚未探明其骨細胞增殖分化的機制，尤其是殼聚糖的作用是在細胞外還是在細胞內，具體的作用點是什么，尚未探明。用殼聚糖及其衍生物對骨組織進行修復研究，在研究中發(fā)現(xiàn)骨組織修復本身是一個非常復雜的過程，不但需要多種蛋白生長因子的參與和協(xié)同作用，而且一些物理化學因素，也對其產生重要的影響。關鍵是殼聚糖及其降解產物參與的協(xié)同作用尚不清晰，有待進一步探索。初步研究表明，殼聚糖類材料不但可以促進細胞的分化，加速組織的形成，而且能夠促進成骨細胞和軟骨細胞的表型表達，其中生長因子的加入，對于骨組織的形成具有重要的影響，尤其是對于骨髓基質干細胞的定向分化，具有重要的調節(jié)作用，但需要更深入的機理性研究。

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Effect of Chitosan on Tissue Repair in Bone Tissue Engineering

JIAO Yanpeng，LI Lihua，LUO Binghong，ZHOU Changren
(Department of Materials Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Materials implanted in the body would inevitably lead to host response，promoting or inhibiting tissue healing.The degradation products of biodegradable materials in the body will change with time，resulting in different host responses and further affecting tissue healing.Therefore，the mechanism of promoting or inhibiting tissue healing becomes the theoretical basis for the design and preparation of novel biomedical polymer materials.Chitosan is one of the ideal medical polymer materials，but we still do not know the effect mechanism of chitosan degradation process on tissue repair in vivo.So it will not be able to design chitosan-based materials with excellent performance.This review does not lay out the progress of the chitosan-based biomaterials applied in bone tissue engineering，but focuses on the complexity of chitosan applications for bone tissue engineering，furthermore investigates the problems needed to be solved for chitosan used in bone tissue engineering.

chitosan;bone tissue engineering;tissue repair

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0035－05

2012－04－18

國家自然科學基金資助項目(81171459，50903039)

焦延鵬，男，1975年生，副研究員

周長忍，男，1956年生，教授，博士生導師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.05