于家文，郭美華，趙春暉，馮 斌

(1. 大連醫(yī)科大學 生物技術系, 遼寧 大連 116044; 2. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116081)

包括多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)在內(nèi)的腦腫瘤治療目前仍是一個挑戰(zhàn)。血腦屏障(BBB)的存在限制了化療藥物到達腫瘤細胞。目前的主要方法是通過外科手術切除大部分腫塊及對浸潤部分的輔助治療。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的浸潤性生長，使它和正常腦組織沒有明顯界限。如何找到手術無法切除的殘存膠質(zhì)瘤細胞，是實現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中有效預后的新課題和焦點。腫瘤細胞表面的特殊分子標記為完成這一目標提供了有效手段。表面結合葉酸[1]、轉(zhuǎn)鐵蛋白[2]、表面生長因子受體(EGFR)的抗體[3]的免疫脂質(zhì)體已經(jīng)應用于含硼化合物BSH和其他治療藥物靶向?qū)肽z質(zhì)瘤細胞的研究中，并取得了較好的動物體內(nèi)、外實驗結果。

腫瘤靶向肽是一類能與腫瘤細胞表面特異受體結合的寡肽。與抗體及其他靶向分子相比，腫瘤靶向肽具有分子量更小、組織穿透能力更強、低免疫原性和高親和力、容易大量合成等優(yōu)點，在藥物靶向?qū)胂到y(tǒng)(drug delivery system, DDS)中具有廣闊的應用前景[4-5]。GL1是一段通過噬菌體展示技術篩選出來的12短肽(LLADTTHHRPWT)。對高表達EGFR的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞ΔGli 36具有高親和性，體內(nèi)實驗證明GL1能夠有效地靶向腫瘤細胞[6]。本研究擬通過構建GL1與EGFP的融合蛋白，重組成為具有靶向作用和帶有熒光示蹤功能的蛋白，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

LA Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、pMD18-T、DNA凝膠回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和EcoR I購于寶生物大連有限公司。KOD DNA聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。Ni2+-樹脂填料購自Novagen公司, Anti-His 鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗購自Invitrogen公司。ECL發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo公司。U87△EGFR細胞由日本岡山大學醫(yī)學部松井秀樹教授惠贈，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 PCR目的片段的擴增：設計兩對引物，在5'端分別加入Nde I和EcoR I酶切位點，以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，對GL1-EGFP和EGFP基因進行擴增。擴增GL1-EGFP的引物為： 5'-CCGCATATGCTTTTAGCTGATACAACGCACCGACCCTG-GACTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'；5'-CCGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。擴增EGFP的引物為：5'-CCGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'；5'-CCGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。PCR反應條件為：94℃ 預變性2 min；94℃ 變性 1 min，65℃退火1 min，72延伸1 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。

1.2.2 克隆載體的構建：1%瓊脂糖凝膠鑒定并回收PCR產(chǎn)物。平末端PCR產(chǎn)物3'末端加A反應為：PCR純化產(chǎn)物6 μL，10×LA Taq buffer 1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，LA Taq DNA聚合酶1 μL，反應總體系10 μL，72℃ 30 min進行加A反應。加A產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過夜后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌JM109中，在含有氨芐青霉素50 mg/L的LB固體平板上培養(yǎng)12～16 h進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，活化后提取質(zhì)粒并用Nde I和EcoR I進行酶切鑒定。重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.3 表達載體的構建：測序后的重組質(zhì)粒酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收插入的目的條帶，與Nde I和EcoR I酶切的pET-22b(+)表達載體連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進行蛋白表達。

1.2.4 目的蛋白的提取純化與Western blotting檢測：含有融合蛋白表達質(zhì)粒的工程菌在37℃培養(yǎng)過夜，菌液稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達，6 h后收集菌體超聲破碎。上清進行 12% SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍染色檢測目的蛋白表達情況。N端帶有His的融合蛋白利用組氨酸親和層析柱(His·Bind Column)進行純化。純化后的蛋白電泳后采用半干式轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用anti-His抗體進行Western blotting檢測。

以抗His-tag的鼠單克隆抗體為一抗，室溫孵育1 h，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠的抗體。 孵育1 h后利用ECL發(fā)光試劑盒進行暗室曝光檢測。

1.2.5 U87△EGFR的細胞培養(yǎng)及共聚焦顯微觀察：細胞培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)，含10%小牛血清(Hyclone), 1%硫酸鏈霉素和青霉素，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。將細胞爬片浸入濃硫酸中過夜，75%乙醇浸泡6 h，三蒸水泡3 h，高壓滅菌后85℃烘干。烘干后的爬片表面用多聚賴氨酸處理后放入12孔板中，向每個孔加入1×105的U87△EGFR細胞，培養(yǎng)24 h后再加入GL1-EGFP和EGFP至終濃度2 μmol/L，培養(yǎng)30 min后，室溫下用PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，PBS清洗3次后共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2 結 果

2.1 PCR目的產(chǎn)物的擴增

通過PCR反應，成功地擴增出了EGFP和GL1-EGFP目的基因，其中EGFP和GL1-EGFP的序列大小分別為737 bp和776 bp(圖1 泳道1和2)。

圖1 EGFP和GL1-EGFP的PCR擴增和克隆重組質(zhì)粒的酶切結果

Fig 1 PCR of EGFP and GL1-EGFP and enzyme digestion of cloning recombinant plasmids

M: DL 2000 DNA 分子量標準; 1: EGFP的PCR擴增; 2: GL1-EGFP的PCR擴增; 3、4: EGFP 克隆重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結果; 5、6: GL1-EGFP克隆重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結果

2.2 克隆載體和表達載體的構建

PCR產(chǎn)物連接到T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選白斑進行質(zhì)粒提取，Nde I 和 EcoRI雙酶切后電泳分析表明： EGFP和GL1-EGFP成功連接到T克隆載體上(圖1泳道3和4)，測序結果顯示EGFP和GL1-EGFP目的基因均無突變。

回收Nde I和EcoR I酶切后的GL1-EGFP和EGFP目的片段，與經(jīng)過同樣酶切的pET-22b(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選重組質(zhì)粒酶切鑒定，表明GL1-EGFP和EGFP插入到表達載體中(圖 2)。

2.3 蛋白的提取純化及Western blotting檢測

含有GL1-EGFP和EGFP表達載體的工程菌經(jīng)IPTG誘導后提取蛋白， SDS-PAGE電泳表明：經(jīng)IPTG誘導的總蛋白中，在29 kD和27 kD可以見到明顯的GL1-EGFP和EGFP表達條帶(圖3 泳道2和5)，而沒加IPTG誘導的總蛋白中未見相應的條帶(圖3泳道3和6)。GL1-EGFP和EGFP的分子量與軟件預測的相同。利用鎳親和層析柱純化后獲得了高濃度的純化GL1-EGFP和EGFP蛋白(圖3 泳道1和4)。

圖2 EGFP和GL1-EGFP的表達重組質(zhì)粒的酶切結果Fig 2 Enzyme digestion of expression recombinant plasmids

M: DL 5000 DNA 分子量標準; 1: EGFP 表達重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結果; 2: GL1-EGFP表達重組質(zhì)粒的Nde I和 EcoRI雙酶切結果

圖3 GL1-EGFP和EGFP表達和純化的SDS-PAGE結果

Fig 3 SDS-PAGE analysis of expression and purification of GL1-EGFP and EGFP

M：蛋白分子量標準; 1: 純化的GL1-EGFP; 2: IPTG誘導GL1-EGFP表達 3：無IPTG誘導GL1-EGFP表達 (對照); 4: 純化的EGFP; 5: IPTG誘導EGFP表達; 6: 無IPTG誘導EGFP表達(對照)

Western blotting 檢測結果顯示，在29 kD和27 kD的相應條帶上，能夠看到相應的雜交信號，證明純化蛋白為帶有組氨酸標簽的GL1-EGFP和EGFP(圖 4)。

圖4 GL1-EGFP和EGFP 的Western blotting檢測

Fig 4 Western blotting analysis of purified GL1-EGFP and EGFP

2.4 GL1-EGFP的體外細胞結合實驗

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87△EGFR分別與GL1-EGFP和EGFP孵育培養(yǎng)30 min后進行共聚焦顯微鏡觀察。GL1-EGFP作用的U87△EGFR細胞表面有很強的綠色熒光(圖5 A)，而對照組EGFP作用的U87△EGFR細胞表面看不到熒光(圖5 B)。

圖5 GL1-EGFP對U87△EGFR靶向作用的共聚焦顯微鏡結果Fig 5 Confocal microscopy analysis of GL1-EGFP binding with U87△EGFR cells in vitroA: EGFP (對照); B: GL1-EGFP

3 討 論

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤目前仍是致死性的腦腫瘤疾病。近年來的藥物靶向傳輸為治療提供了一條可行途徑。但是腦血屏障的存在和腫瘤細胞的浸潤生長特性限制了藥物有效地到達腫瘤細胞，進而影響藥效，因此利用對腦瘤細胞具有靶向性的小分子多肽來攜帶藥物定向運輸?shù)侥X腫瘤細胞具有廣闊的前景[7]。本研究所用的GL1靶向肽序列是通過噬菌體展示技術針對膠質(zhì)瘤細胞Gli36分離出來的，研究表明其對其他一些神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，如SNB19、U343MG、SF767和U373MG也具有一定的靶向作用[6]。十二肽的GL1(LLADTTHHRPWT)是相對疏水的，尤其在N端的亮氨酸leucine(L)，C端的脯氨酸(P)和色氨酸(W)，這樣GL1有可能通過疏水部分錨定腫瘤細胞的跨膜域。Hopp等[8]認為，蛋白的抗原性一般與特殊氨基酸的親水性有關。GL1的親水指數(shù)是-0.3，說明這個肽具有略微疏水特性，不會引起抗原反應。GL1與EGFP融合后，位于EGFP的N端，GL1-EGFP融合蛋白仍然能夠有效地表達并發(fā)出綠色熒光，說明沒有影響EGFP的有效折疊和正確構象。

在構建克隆質(zhì)粒的過程中，本研究發(fā)現(xiàn)，重組T載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌XLI-blue中的時候，攜帶GL1-EGFP的克隆質(zhì)粒的菌體高效的表達了所需要的目的蛋白，而這種情況在感受態(tài)大腸桿菌JM109中卻沒有發(fā)生。測序分析表明：GL1-EGFP插入LacZ基因內(nèi)部，沒有打斷原有β-半乳糖苷酶基因α-肽的讀碼框，并實現(xiàn)了順碼通讀，在lac啟動子的作用下進行了高效的表達，表達的GL1-EGFP的N端和C端各帶有β-半乳糖苷酶α-多肽的片段。

GL1-EGFP與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的體外結合實驗說明GL1能夠在30 min時間內(nèi)就錨定到腫瘤細胞表面，而沒有GL1的EGFP對細胞沒有結合作用，直觀的證明了GL1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的靶向作用，為下一步改造GL1應用于腦腫瘤的靶向治療提供依據(jù)。GL1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞只具有錨定靶向作用，在細胞內(nèi)部還沒有觀察到EGFP的綠色熒光。研究表明：細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)能夠?qū)⑸锎蠓肿訉爰毎麅?nèi)部，常用的CPPs有人類免疫缺陷病毒(HIV)的TAT 的蛋白轉(zhuǎn)導域(protein transduction domain, PTD)和聚賴氨酸[9-10]。GL1如果應用于藥物傳輸系統(tǒng)需要將蛋白或者載荷導入到細胞內(nèi)部，因此對GL1進行改造

將蛋白或載荷導入腫瘤細胞內(nèi)部是下一步的研究內(nèi)容。此外，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性，找到GL1的腫瘤細胞表面作用蛋白和位點也是具有挑戰(zhàn)性的工作，這將為腦腫瘤藥物的有效靶向運輸和治療提供依據(jù)。

[1] Pan XQ, Wang H, Lee RJ. Boron delivery to a murine lung carcinoma using folate receptor-targeted liposomes [J]. Anticancer Res, 2002, 22(3):1629-1633.

[2] Maruyama K, Ishida O, Kasaoka S, et al. Intracellular targeting of sodium mercaptoundecahydrododecaborate (BSH) to solid tumors by transferrin-PEG liposomes, for boron neutron-capture therapy (BNCT) [J]. J Control Release 2004, 98(2):195-207.

[3] Feng B, Tomizawa K, Michiue H, et al. Delivery of sodium borocaptate to glioma cells using immunoliposome conjugated with anti-EGFR antibodies by ZZ-His [J]. Biomaterials, 2009, 30(9):1746-1755.

[4] Del Vecchio CA, Li G, Wong AJ.Targeting EGF receptor variant III: tumor-specific peptide vaccination for malig-nant gliomas[J]. Expert Rev Vaccines,2012, 11(2):133-144.

[5] Chunxiao Wu, Seong Loong Lo, Jerome Boulaire, et al. A peptide-based carrier for intracellular delivery of proteins into malignant glial cells in vitro[J]. J Control Release, 2008, 130(2): 140-145.

[6] Ho IA, Hui KM, Lam PY. Isolation of peptide ligands that interact specifically with human glioma cells [J]. Peptides, 2010, 31(4):644-650.

[7] Bidros DS, Vogelbaum MA. Novel drug delivery strategies in neuro-oncology [J]. Neurotherapeutics, 2009, 6(3):539-546.

[8] Hopp TP,Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78(6):3824-3828.

[9] Snyder EL, Dowdy SF. Recent advances in the use of protein transduction domains for the delivery of peptides, proteins and nucleic acids in vivo[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2005, 2(1):43-51.

[10] Hitsuda T, Michiue H, Kitamatsu M. A protein transduction method using oligo-arginine (3R) for the delivery of transcription factors into cell nuclei [J]. Biomaterials, 2012, 33(18):4665-4672.