劉 奔，鐘民濤，王曉麗，孫文長(zhǎng)，寧安紅，李星云，劉 磊，黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

香菇菌C91-3具有氣味甘平、無(wú)毒、健脾益氣、扶正祛邪,調(diào)和陰陽(yáng)的藥食兼用特點(diǎn)[1]。以往的研究表明其發(fā)酵液具有良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌作用。其發(fā)酵液中除含有大量多糖和氨基酸成分外,還含有多種蛋白成分。經(jīng)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中的一些蛋白組分具有很高的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[2-3]。為明確香菇菌中蛋白的抗腫瘤作用，本課題組對(duì)其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序，獲得了香菇菌C91-3的轉(zhuǎn)錄組序列。通過(guò)GenBANK、SWISS-MODEL等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，初步篩選確定了其凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組序列，并根據(jù)此轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物，用3′-Full RACE、5′-Full RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends)方法獲得了基因全長(zhǎng)。通過(guò)畢赤酵母表達(dá)體系誘導(dǎo)表達(dá)出此目的蛋白，并將鑒定后的蛋白作用于小鼠肝癌細(xì)胞Hca，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞Hca生物學(xué)功能的影響，進(jìn)而分析其是否具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，為進(jìn)一步深入研究香菇菌C91-3的抗腫瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器：低溫離心機(jī)：Eppendorf ，德國(guó)。 PCR擴(kuò)增儀：Takara Thermal Cycler TP600，Takara BIO INC。超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1FD型，蚌埠凈化設(shè)備廠。核酸電泳儀：Mupid，ADVANCE-BIO Co.,Ltd。蛋白電泳儀：EPS300，上海天能。凝膠成像分析系統(tǒng)：北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠?；驕y(cè)序儀：ABI PRISMTM3730XL DNA Sequencer，Applied Biosystem。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：總RNA提取Trizol試劑盒、Penta.His Antibody、HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)購(gòu)自invitrogen公司，3′-Full RACE Core Set Ver 2.0 、5′-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1 Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及實(shí)驗(yàn)所需各種引物、酶類均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，各種培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室配置。

1.1.3 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株：質(zhì)粒pPIC9K、菌株DH5α、畢赤酵母GS115購(gòu)自invitrogen公司(中國(guó))；小鼠肝癌細(xì)胞Hca購(gòu)自中科院上海生化與細(xì)胞所；雞胚成纖維細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香菇菌C91-3總RNA提取與24414基因CDS區(qū)序列的獲得：取綜合馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 d的香菇菌C91-3的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，用Trizol試劑盒按說(shuō)明一步法提取總RNA，將所得總RNA溶于50 μL DEPC水中。引物設(shè)計(jì)采用oligo 6.0設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)合成3′-RACE、5′-RACE實(shí)驗(yàn)所需特異性引物，通過(guò)3′-Full RACE、5′-Full RACE反應(yīng)得到香菇菌C91-3 24414基因CDS區(qū)序列。實(shí)驗(yàn)所需引物序列如下：

(5′→ 3′)：3′RACE Outer Primer 1：GAAATGGTCCTAGTTCCCGTG； 3′RACE Outer Primer 2：TA-GATGCCAGGGACCGCTTCT； 3′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG； 3′RACE Inner Primer 2： AGTAGGGCTTCATGTGCTT； 5′RACE Outer Primer 1：CCGGGAATGTGTCTGTTGTTA； 5′RACE Outer Primer 2：CCGTTTTACAAGTTT-TTCGTT； 5′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG； 5′RACE Inner Primer 2：ATGCGCGTAGGTAGACTTTGA； F Primer：ACTGGCGCGTGAGCCACTCG； R Primer：GCCCTG-AGGTCCAAACATTG； R1seq primer：ACCTCGGCAACAAACCCCAA； 5′AOX I primer：GACTGGTTCCAATTGACAAGC； 3′AOX I primer：GGCAAATGGCATTCTGACAT。

1.2.2 酵母真核表達(dá)載體構(gòu)建、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)：構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-24414，采用畢赤酵母GS115體系進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其目的蛋白末端加入6×His鑒定、純化標(biāo)簽，得到鑒定的香菇菌C91-3凋亡相關(guān)目的蛋白24414[4]。

1.2.3 MTT法測(cè)定目的蛋白的抑瘤率：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hca小鼠肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，加于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，終體積200 μL。實(shí)驗(yàn)分為5組：不同濃度目的蛋白3組，化療藥物順鉑(DDP)組與培養(yǎng)基空白對(duì)照組。所有成分用RPMI-1640配制，目的蛋白為鑒定后的誘導(dǎo)表達(dá)72 h的產(chǎn)物，分別稀釋至終濃度7.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL，化療藥物DDP終濃度為5.0 μg/mL，于37 ℃作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hca細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，用 MTT法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm，參考波長(zhǎng)655 nm，按照下面公式計(jì)算抑瘤率(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率)：IR(inhibited rate)=(對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/對(duì)照組平均A值×100%。

1.2.4 目的蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞Hca凋亡作用檢測(cè)：細(xì)胞分組同上，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌Hca細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，加入25 mL培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL。用藥及藥物作用濃度同上，混勻后，37 ℃，5%CO2孵育24 h，細(xì)胞懸液800 r/min，離心3 min，再以PBS洗滌1次，800 r/min離心3 min；按試劑盒說(shuō)明加入Annexin/PI染液，避光孵育15 min后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 目的蛋白對(duì)正常雞胚成纖維細(xì)胞毒性檢測(cè)：制備雞胚成纖維細(xì)胞懸液[5]，分組同上，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，分裝于96孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，觀察雞胚成纖維細(xì)胞貼壁良好時(shí)用藥同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h、48 h、72 h采用 MTT法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm，參考波長(zhǎng)655 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用組間t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 香菇菌C91-3總RNA提取

取5 μL總RNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，marker上樣量為5 μL，結(jié)果見(jiàn)圖1，示RNA完整無(wú)降解。

2.2 香菇菌C91-3 24414基因CDS區(qū)獲得

RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL的RT-PCR反應(yīng)液進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，marker上樣量為5 μL，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖2。在大約3000 bp處可見(jiàn)清晰條帶，條帶大小與拼接結(jié)果吻合，同時(shí)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶陰性對(duì)照[M-MLV(-)]無(wú)條帶出現(xiàn)，示無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。

圖1 香菇菌C91-3總RNAFig 1 Total RNA of Lentinus edodes C91-31：香菇菌C91-3總RNA； M：DNA Marker DL2000

圖2 香菇菌C91-324414基因CDS序列全長(zhǎng)Fig 2 Full CDS sequence of Lentinus edodes C91-3 24414 gene

M：DNA Markerλ-Hind Ⅲ digest ；1：M-MLV(-)PCR 產(chǎn)物；2：PCR 產(chǎn)物

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的鑒定

通過(guò)Western-blot方法確認(rèn)目的蛋白的表達(dá)情況，一抗稀釋倍數(shù)為1∶1000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶1000，顯色底物為True Blue Peroxidase Substrate，反應(yīng)條件均為室溫1 h,結(jié)果見(jiàn)圖3。在蛋白電泳大于110 kD位置處有抗His-Tag 陽(yáng)性的蛋白條帶，空載體對(duì)照組無(wú)條帶。

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間目的蛋白的鑒定

Fig 3 Characterization of target protein on different time span of induction

M：Precision Plus Protein Standards Dual color ； 1：24414-1胞外 (72 h)；2：24414-1胞外 (48 h)； 3：24414-1胞外 (24 h)；4：空載體pPIC9K 胞外 (48 h)

2.4 MTT法測(cè)定目的蛋白的抑瘤率

不同作用時(shí)間、不同濃度的目的蛋白對(duì)Hca細(xì)胞的MTT檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1，抑瘤率見(jiàn)表2。24 h后，蛋白作用組與DDP作用組的A值與對(duì)照組比較差異即有顯著性意義(P<0.05)，且蛋白作用組的A值與DDP作用組比較差異也有顯著性意義(P<0.05)。表2所示，Hca細(xì)胞在各濃度目的蛋白作用下，生長(zhǎng)明顯受到抑制，其抑制水平超過(guò)5 μg /mL DDP的作用。

表1 不同時(shí)間、不同濃度的目的蛋白對(duì)Hca細(xì)胞的MTT檢測(cè)結(jié)果Tab 1 The MTT result of the expressed protein to Hca cell on different time span (±s)

1) 與對(duì)照組比較，P<0.05；2) 與5 μg/mL DDP組比較，P<0.05

表2不同時(shí)間、不同濃度目的蛋白對(duì)Hca細(xì)胞的抑瘤率

Tab 1 Cell inhibited rate of the expressed protein to Hca cell on different time span(%)

2.5 目的蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞Hca凋亡作用檢測(cè)

目的蛋白作用于Hca細(xì)胞24 h后，經(jīng)Annexin/PI雙染色法染色，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，測(cè)量3次，以Cell Quest軟件分析檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果，見(jiàn)表3和圖4。圖4中，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，左上象限為死亡細(xì)胞，左下象限為正常狀態(tài)細(xì)胞。結(jié)果表明，目的蛋白作用濃度為7.5 μg/mL時(shí)，其晚期凋亡率已高于對(duì)照組細(xì)胞，即對(duì)Hca細(xì)胞已具有誘導(dǎo)凋亡的作用，濃度為30 μg/mL時(shí)誘導(dǎo)凋亡的作用最強(qiáng)，早晚兩期凋亡率最高。腫瘤細(xì)胞在蛋白的作用下對(duì)理化作用的耐受性降低，細(xì)胞碎片增多，死亡細(xì)胞數(shù)目亦明顯增多。

表3 不同濃度的目的蛋白對(duì)Hca細(xì)胞的凋亡率Tab 2 The apoptosis rate of the expressed protein on Hca cell (%)

1) 與對(duì)照組比較，P<0.05

2.6 目的蛋白對(duì)正常雞胚成纖維細(xì)胞的毒性檢測(cè)

不同濃度目的蛋白對(duì)正常雞胚成纖維細(xì)胞的毒性檢測(cè)見(jiàn)表4。雞胚成纖維細(xì)胞在不同濃度的目的蛋白作用下生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制，與對(duì)照組比較差異沒(méi)有顯著性意義。而在5 μg /mL 的DDP作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)在24 h即出現(xiàn)抑制，與對(duì)照組、各蛋白作用組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

對(duì)照組目的蛋白組7.5μg/mL15μg/mL3μg/mL5μg/mLDDP24h1.817±0.0641.657±0.0891.789±0.1491.581±0.1400.773±0.4121)48h1.059±0.1000.990±0.0791.070±0.1541.118±0.1220.693±0.0901)72h0.939±0.0770.903±0.0810.931±0.1730.827±0.1090.522±0.0631)

1) 與其余4組比較，P<0.05

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的、信號(hào)依賴的過(guò)程，它可以由許多因素所誘導(dǎo)，如放射線照射、毒素、藥物、缺血缺氧、病毒感染等。和細(xì)胞增殖一樣，細(xì)胞凋亡也是受基因調(diào)控的精確過(guò)程[6]。目前，已經(jīng)證實(shí)的凋亡相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程中均起到關(guān)鍵作用[7]。研究表明，香菇菌提取物除具有抗病毒、抗細(xì)菌及免疫調(diào)節(jié)等生物功能外還具有抑制腫瘤增殖的功能[8]。Liao CH等[9]從松衫靈芝中提取的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的肺癌A549腫瘤細(xì)胞過(guò)早地凋亡和過(guò)早地衰老，證明了具有體外直接殺傷腫瘤作用的蛋白成分在藥用真菌中真實(shí)存在。Hsu HC等[10]從草菇中分離的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，進(jìn)一步證明從真菌中可以分離得到具有直接抗腫瘤作用的蛋白。本課題組從香菇菌C91-3菌絲體發(fā)酵液中提取的蛋白LFP91-3就已在抗多種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中取得了良好的結(jié)果[2-3]， 并已證實(shí)該發(fā)酵液蛋白具有體外抗腫瘤和體內(nèi)直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[2,11]。

本課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、凋亡相關(guān)蛋白序列比對(duì)、真核表達(dá)載體構(gòu)建、酵母系統(tǒng)表達(dá)等手段得到了香菇菌C91-3凋亡相關(guān)蛋白24414，目的蛋白在1%甲醇誘導(dǎo)后24 h即有表達(dá)，表達(dá)量較恒定，經(jīng)檢測(cè)在72 h達(dá)到峰值0.3 mg/mL[4]。MTT法進(jìn)行體外抗腫瘤活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞Hca具有明顯的抑制作用，7.5 μg /mL、15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白的抑制率在24 h分別為50.49%、72.84%和72.96%。作用48 h后，15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白組出現(xiàn)組內(nèi)最大抑制率，分別為82.02%和74.66%，可以看出此蛋白對(duì)Hca細(xì)胞的抑制率不完全是時(shí)間、濃度依賴性的。作者分析這與生長(zhǎng)抑制作用通路中的某些因素有關(guān)，其具體機(jī)制需要深入研究。作用24 h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，目的蛋白作用濃度為7.5 μg/mL時(shí)，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.47%和4.26%；目的蛋白作用濃度為30 μg /mL時(shí)，早期凋亡率和晚期凋亡率分別達(dá)到9.28%和9.37%，兩期凋亡率均隨蛋白作用濃度增加而增加，晚期凋亡略占優(yōu)勢(shì)。此結(jié)果證實(shí)，該蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，在作用24 h時(shí)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的早期凋亡率和晚期凋亡率隨著單一蛋白作用濃度的增加而增加，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，從毒性檢測(cè)的結(jié)果中可以看出此蛋白對(duì)正常雞胚成纖維細(xì)胞無(wú)毒性作用，雞胚成纖維細(xì)胞在不同濃度的目的蛋白作用下生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制，與對(duì)照組比較差異沒(méi)有顯著性意義。這一結(jié)果表明該蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有腫瘤細(xì)胞選擇性，其具體的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制、途徑有待研究。

目前的抗癌藥物多是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其細(xì)胞毒副作用。但幾乎所有的抗癌藥物都存在不同程度的毒副作用。抗癌藥物的抑瘤效果和毒副作用對(duì)其劑量存在的依賴性,產(chǎn)生了治療與毒副作用的矛盾[12]。因此,篩選低毒或無(wú)毒副作用且抑癌效率高的抗癌藥物具有很高的臨床價(jià)值。本課題組將繼續(xù)對(duì)此蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究。

[1] Zhao C, Sun H, Tong X,et al.An Antitumor lectin from edible Mushroon Agrocbe aegerita[J]. Biochem J, 2003,374:321-327.

[2] 黃敏,寧安紅,張卓然,等.香菇C91-3菌絲發(fā)酵液小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 1996, 8 (3) : 38-40.

[3] 戴兵,黃敏,寧安紅,等.香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2004,26(9): 656-658.

[4] 劉奔，鐘民濤，王曉麗，等. 香菇菌C91-3凋亡相關(guān)蛋白24414在畢赤酵母GS115中的表達(dá)與鑒定[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24(2)：161-165.

[5] 張卓然.培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004.62-63.

[6] Yiying Zhang,Yuanlin Dong,Xu Wu,et al.The Mitochondrial Pathway of anesthetic Isoflurane- induced apoptosis[J]. J Biological Chem,2010,285(6):4025-4037.

[7] Sung YK, Eun SY, Young SL, et al. Sensitive to apoptosis gene protein regulates ionizing radiation-induced apoptosis[J]. Biochimie,2011,93(2):269-272.

[8] 叢陽(yáng)，黃敏. 香菇多糖抗腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(4)：465-469.

[9] Liao CH, Hsiao YM, Lin CH, et al. Induction of premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae[J]. Food Chem Toxicol, 2008,46:1851-1859.

[10] Hsu HC，Hsu CI，Lin RH,et al. Fip-vvo, a new fungal immunomodulatory protein isolated from Volvariella volvacea[J]. Biochem,1997,323 (2): 557-565.

[11] 趙越,黃敏,王曉麗,等.香菇C9123 菌絲發(fā)酵液蛋白LFP91-3C 小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫機(jī)制研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(3):226-228.

[12] 高船舟,曲淑賢,呂廣艷,等.20(R)-人參皂甙Rg3對(duì)K562/ADM細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,23(3)：171-173.