陳驍馳，楊德勇，車翔宇，王建伯，陳 峰，宋希雙

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

PSMA靶向性小分子谷氨酸尿素類似物Glu-urea-Lys的合成

陳驍馳，楊德勇，車翔宇，王建伯，陳 峰，宋希雙

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

［目的］探索前列腺特異性膜抗原(PSMA)靶向性谷氨酸尿素小分子的合成。［方法］按照標(biāo)準(zhǔn)的無水無氧操作技術(shù)進(jìn)行實驗操作;應(yīng)用核磁共振光譜儀與高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行化合物成分測定分析。［結(jié)果］經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法分析，確認(rèn)得到以谷氨酸尿素為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的小分子化合物Glu-urea-Lys。［結(jié)論］以Glu-urea-Lys為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的研究，將為前列腺癌分子影像學(xué)診斷及靶向治療領(lǐng)域提供理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。

PSMA;Glu-urea-Lys;前列腺癌

前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是位于前列腺上皮細(xì)胞表面的II型跨膜糖蛋白。PSMA在正常前列腺以及前列腺增生細(xì)胞表面有所表達(dá)，在絕大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞中其表達(dá)明顯上調(diào)［1］。PSMA具有葉酸水解酶及N-乙酰基化α-連接的酸性二肽酶 (NAALADase)活性，能夠通過網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞機(jī)制產(chǎn)生內(nèi)化效應(yīng)。雖然PSMA調(diào)控前列腺癌惡性表型的分子機(jī)制尚不明確，與前列腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、分期、分級等臨床參數(shù)之間的關(guān)系仍有爭議，但PSMA在前列腺癌細(xì)胞表面特異性高表達(dá)的生物學(xué)特征及內(nèi)化效應(yīng)，使其在前列腺癌分子影像學(xué)及靶向治療領(lǐng)域具有極為重要的研究價值［2］。已有研究表明，核素等物質(zhì)標(biāo)記的PSMA單克隆抗體在前列腺癌的分子影像學(xué)診斷及靶向治療方面顯示出一定的臨床應(yīng)用前景［3-4］。然而，PSMA 單克隆抗體屬于大分子蛋白類物質(zhì)，對前列腺癌腫瘤實質(zhì)，尤其對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及骨轉(zhuǎn)移前列腺癌的滲透性差，循環(huán)半衰期長，與非特異性組織結(jié)合后清除速度慢，體內(nèi)應(yīng)用副作用較大，容易引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，而且單克隆抗體生產(chǎn)成本高，保存過程中生物活性容易發(fā)生改變，因此限制了其在前列腺癌診斷及治療中的應(yīng)用。

為了改進(jìn)前列腺癌的診斷及治療方法，近年來研究人員開發(fā)出一系列PSMA靶向性小分子物質(zhì)，可以特異性作用于前列腺癌細(xì)胞。谷氨酸尿素小分子及其類似物(Glu-urea-R)是葉酸水解酶I活性抑制劑，同時能夠競爭性抑制PSMA的NAALADase酶活性，因此能夠高效、靶向的與前列腺癌細(xì)胞表面的PSMA相結(jié)合，并且通過內(nèi)化作用進(jìn)入到前列腺癌細(xì)胞內(nèi)。在Glu-urea-R的空間結(jié)構(gòu)中，Gluurea為PSMA綁定端，R基團(tuán)為其它化學(xué)基團(tuán)偶聯(lián)端。與PSMA的單克隆抗體相比，Glu-urea-R生物學(xué)活性穩(wěn)定，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，對于腫瘤實質(zhì)以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶滲透性好，體內(nèi)應(yīng)用副作用低。研究表明，某些生物制劑與分子影像學(xué)顯象劑可以與Glu-urea-R結(jié)合，靶向作用于前列腺癌細(xì)胞，例如脂質(zhì)體、反義核苷酸、免疫與蛋白制劑、治療性siRNA、核素等。作為PSMA靶向性的小分子物質(zhì)，Glu-urea-R具有便于合成及純化、易于連接其它物質(zhì)、易溶于水、能夠穩(wěn)定儲存等特點。Gluurea-R在前列腺癌分子影像學(xué)及靶向治療方面具有極高的應(yīng)用價值，目前國內(nèi)尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子研制的報道。本文以賴氨酸(Lys)替換R集團(tuán)，探討Glu-urea-Lys的合成。

1 材料和方法

1.1 分子篩

用于干燥有機(jī)溶劑的4A或5A分子篩，必須先經(jīng)過活化:將其在馬弗爐中400℃煅燒4 h，然后置于干燥器中冷卻至室溫備用。

1.2 溶 劑

將二氯甲烷先經(jīng)過5A分子篩浸泡后，在高純氮氣的保護(hù)下，以CaH2作為除水劑，加熱回流6 h。常壓蒸出，保存于Schlenk瓶中備用。

1.3 實驗儀器

1.3.1 核磁共振光譜儀:Varian INOVA 400 MHz核磁共振光譜儀:化學(xué)位移(δ)單位為ppm，耦合常數(shù)(J單位為Hz。峰形表示為:s=單峰，d=雙峰，t=三重峰，m=多重峰，br=寬峰。

1.3.2 高分辨質(zhì)譜:液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀:HPLC/Q-Tof MS(英國 Micromass公司)。雙正交設(shè)計的ZSprayTM大氣壓電離源，四級桿質(zhì)量過濾器，Q-Tof分析器。電噴霧離子源，操作正離子模式。

1.4 實驗路線

見式1。

式1 目標(biāo)化合物的合成路線Scheme 1 synthetic route to the title compound

1.5 實驗方法

如沒有特殊說明，本實驗操作均在無水無氧條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)的Schlenk技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

將固體光氣(290 mg，1 mmol)用無水二氯甲烷(6 mL)溶于裝有恒壓漏斗的三口圓底燒瓶中，形成懸濁液，并將反應(yīng)液冷卻至0℃。

在恒壓漏斗中加入溶有化合物1(1.008 g，2.7 mmol)和 N，N - 二異丙基乙胺(1.3 mL，7 mmol)的二氯甲烷((5 mL)溶液。

保持反應(yīng)液0℃，將恒壓漏斗中的溶液滴加到三口瓶中，50 min左右滴加完畢，繼續(xù)攪拌30 min。

將化合物2(0.8 g，2.7 mmol)和 N，N - 二異丙基乙胺(1.04 mL，6 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，一次性加入到三口瓶中，保持0℃繼續(xù)攪拌30 min。

反應(yīng)液用30 mL水稀釋，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，有機(jī)相用50 mL飽和食鹽水洗滌，并用無水硫酸鈉干燥得到黃色油狀物，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1至2∶1)分離，得到白色固體化合物3;所得化合物3經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法進(jìn)行成分分析測定。

將化合物3(1.32 g，2.13 mmol)溶于乙醇(15 mL)中，加入甲酸銨(1.32 g，10 eqv.)于反應(yīng)液中，然后加入Pd-C(10%，260 mg)，室溫攪拌過夜至完全。反應(yīng)液用硅藻土過濾后，濾餅用乙醇洗(4×8 mL)，濃縮得到粗產(chǎn)物1.07 g。柱層析(二氯甲烷∶甲醇 =30∶1至8∶1)分離，得到油狀物化合物4。所得化合物4經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法進(jìn)行成分分析測定。

2 結(jié) 果

化合物3(1.37 g，82%)，作為最終產(chǎn)物4的原料，性狀為白色固體，為了確定化合物3的結(jié)構(gòu)的正確性，對其進(jìn)行了核磁共振波譜分析和高分辨質(zhì)譜分析。其中氫原子(H)核磁共振波譜的數(shù)據(jù)如下:氫-核磁共振(1H NMR)(400兆赫茲(MHz)，氘代氯仿(CDCl3))δ 7.40 -7.27(m，5H)，5.37 -5.30(m，3H)，5.11(d，J=10.2 Hz，2H)，4.38 -4.31(m，2H)，3.19 -3.14(m，2H)，2.31 -2.25(m，2H)，2.06 -2.03(m，1H)，1.90 -1.40(m，34H)(圖1)。液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對分子結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分析，高分辨質(zhì)譜(ESMS)顯示為:質(zhì)核比(m/z)為:622(M+H)+。

從1H NMR可以看出，分子中有 51個氫。1.40-1.90處中有27個氫是化合物3中的叔丁基的特征峰;7.27-7.40處出現(xiàn)的5個氫，屬于芐基芳環(huán)的氫;5.11處出現(xiàn)的氫為芐基碳上面的氫;而4.31-4.38 與 3.14 -3.19 處的峰為結(jié)構(gòu)中與氮(N)相連的碳上面的氫，這種氫相對于其他非鄰近N的碳上面的氫，化學(xué)位移要往低場移一些;N上面的氫的峰出現(xiàn)在5.30-5.37處。

通過高分辨質(zhì)譜，測出產(chǎn)物的分子量為622，液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的電離源為電噴霧離子源，電離方式為軟電離，這樣必須額外加上一個氫的正電荷，才能在液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜中出峰，所以實際的分子量為621。

綜合1H NMR和高分辨質(zhì)譜的測試，可以確定合成出的化合物3正確。

化合物4(550 mg，53%)，為油狀物，為了確定化合物3的結(jié)構(gòu)的正確性，對其進(jìn)行了核磁共振波譜分析和高分辨質(zhì)譜分析。其中H核磁共振波譜的數(shù)據(jù)如下:1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 4.32-4.29(m，2H)，3.08 -3.01(m，4H)，2.84 -2.80(m，2H)，2.35 -2.29(m，2H)，2.08 -2.06(m，1H)，1.86 -1.42(m，34H)(圖2)。液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對分子結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分析，高分辨質(zhì)譜(ESMS)顯示為:m/z:488(M+H)+。

從1H NMR可以看出，分子中有 45個氫。1.42-1.86處中有27個氫是化合物4中的叔丁基的特征峰;在原料化合物3中，7.27-7.40處出現(xiàn)的5個氫和5.11處出現(xiàn)的氫在化合物4的譜圖中均消失了，證明反應(yīng)確實是脫掉了氨基上面的芐基，脫掉芐基正是這一步反應(yīng)的目的;3.01-3.08處出現(xiàn)的4個氫為分子中氨基上面的氫;而4.29-4.32與3.01-3.08處的峰為結(jié)構(gòu)中與氮(N)相連的碳上面的氫。

通過高分辨質(zhì)譜，測出產(chǎn)物的分子量為488，液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的電離源為電噴霧離子源，電離方式為軟電離，這樣必須額外加上一個氫的正電荷，才能在液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜中出峰，所以實際的分子量為487。

綜合1H NMR和高分辨質(zhì)譜的測試，可以確定合成出的化合物4正確。

圖1 化合物3的1H-NMR譜圖Fig 1 The1H-NMR spectra of compound 3

圖2 化合物4的1H-NMR譜圖Fig 2 The1H-NMR spectra of compound 4

3 討 論

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在男性人群中前列腺癌是僅次于肺癌的第二常見腫瘤，占男性惡性腫瘤的10%［5］。前列腺癌微病灶的早期發(fā)現(xiàn)及腫瘤靶向治療對患者的存活率有著深遠(yuǎn)影響。盡管傳統(tǒng)影像學(xué)方法(B超、CT、MRI)的靈敏性與精確度取得了長足的進(jìn)步，但是仍然較難對早期微小前列腺癌作出明確的診斷;臨床上更缺乏前列腺癌靶向性化療藥物的應(yīng)用。近年來，PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其類似物在前列腺癌分子影像學(xué)診斷及靶向治療中的作用正日益受到關(guān)注。

Maresca等［6］設(shè)計、合成了若干易于被核素123I，131I標(biāo)記的Glu-urea-R，并認(rèn)為R基團(tuán)以及與其偶聯(lián)底物的化學(xué)性質(zhì)可以顯著影響Glu-urea-R與 PSMA的親和力。Kularatne等［7］將 Gluurea-R與99mTc-Dap-Asp-Cys螯合物進(jìn)行偶聯(lián)得到可能用于SPECT診斷前列腺癌的分子影像學(xué)探針;而將Glu-urea-R與化療藥物TubH相結(jié)合可以在體外細(xì)胞實驗中殺死PSMA陽性表達(dá)的LNCaP細(xì)胞。Zhang等［8］將 Glu-urea-R 與 DNP偶聯(lián)，通過Glu-urea端靶向識別前列腺癌，通過DNP端募集體內(nèi)免疫殺傷相關(guān)抗體以期望對前列腺癌起到靶向免疫治療的作用。研究表明Glu-urea-R中的R集團(tuán)可以被不同的氨基酸所替代，例如以谷氨酸尿素酪氨酸為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的［125I］DCIT，以谷氨酸尿素半胱氨酸為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的［11C］DCMC與［18F］DCFBC，以谷氨酸尿素賴氨酸為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的［99mTc］L1等，這些小分子物質(zhì)都對PSMA顯示出高特異性與親和力。由于許多生物制劑與分子影像學(xué)顯象劑能夠通過ε氨基與Lys-C(O)-Glu結(jié)構(gòu)相連接，因此以Lys替換Glu-urea-R中的R集團(tuán)在前列腺癌分子影像學(xué)診斷及靶向治療領(lǐng)域中有著廣闊的研究前景。

目前，國內(nèi)尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其類似物研制的報道。本課題組應(yīng)用固體光氣等原料，在無水無氧條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)的Schlenk技術(shù)規(guī)范操作，最終得到油狀物化合物，經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法分析，確認(rèn)此物質(zhì)為目的化合物Glu-urea-Lys;研究表明，在 Glu-urea-R結(jié)構(gòu)中，當(dāng)R基團(tuán)含有第三羧基時，Glu-urea-R能夠高親和性的綁定到PSMA的活性位點，而Lys可以提供自由的第三羧酸官能團(tuán)，因此Glu-urea-Lys小分子能夠靶向性與PSMA相結(jié)合。根據(jù)Gluurea-Lys易于連接其他化學(xué)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點及其能夠靶向性綁定前列腺特異性膜抗原PSMA的分子生物學(xué)屬性，本課題組在今后的實驗中將以此為基礎(chǔ)，應(yīng)用正電子核素標(biāo)記Glu-urea-Lys，探索高靈敏性、高特異性的前列腺癌PET/CT分子探針的合成方法，研究其對前列腺癌PET/CT的成像特征;并進(jìn)一步將Glu-urea-Lys從分子影像學(xué)延伸至前列腺癌基因、藥物靶向治療領(lǐng)域，為前列腺癌的早期診斷，術(shù)前分期，術(shù)后復(fù)發(fā)再分期，前列腺癌的靶向治療以及靶向治療患者的選擇、療效評估與監(jiān)測提供新的策略。

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Synthesis of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue

CHEN Xiao-chi，YANG De-yong，CHE Xiang-yu，WANG Jian-bo，CHEN Feng，SONG Xi-shuang
(Department of Urinary Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To search for the synthetic method of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue.［Methods］All reactions are carried out in dry glassware under an atmosphere of anaerobic conditions for experimental operation.We use nuclear magnetic resonance spectrometer and high-resolution mass spectrometer to analyze the ingredients of compound.［Results］We get the confirmed compound through nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrography.［Conclusion］The studies based on Glu-urea-Lys will offer the experimental and theoretical basis for the molecular iconography diagnosis and targeted therapies of prostate cancer.

Key words:PSMA;Glu-urea-Lys;prostate cancer

R34

A

1671-7295(2012)01-0013-05

國家自然科學(xué)基金項目(30670544)

2011-12-16;

2011-12-20

陳驍馳(1981-)，男，遼寧錦州人，博士研究生。

宋希雙，教授。E-mail:song-xishuang@163.com