楊凱，繆曉燕，陳瓊斯，章婷婷，葉薇，呂建新

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

甲苯生物降解的關(guān)鍵酶基因克隆及表達(dá)

楊凱，繆曉燕，陳瓊斯，章婷婷，葉薇，呂建新

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：克隆、表達(dá)惡臭假單胞菌生物降解甲苯的關(guān)鍵酶基因。方法：惡臭假單胞菌WZ-1在含甲苯的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)以鑒定其降解甲苯的能力。設(shè)計引物擴增甲苯生物降解的關(guān)鍵酶——甲苯雙加氧酶和鄰苯二酚1，2雙加氧酶基因，PCR擴增目的片段后進(jìn)行T-A克隆，篩選陽性克隆并鑒定。構(gòu)建甲苯雙加氧酶-pET28a進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果：惡臭假單胞菌WZ-1在含甲苯的MS培養(yǎng)基的生長曲線證明其具有降解甲苯的能力；通過重組技術(shù)獲得陽性克隆，并以酶切、DNA測序進(jìn)行鑒定；IPTG誘導(dǎo)后獲得重組甲苯雙加氧酶的高表達(dá)。結(jié)論：成功獲得了用于降解甲苯的甲苯雙加氧酶基因和鄰苯二酚1，2雙加氧酶基因，并在體外誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，為后續(xù)利用模式生物對苯系物的生物降解建立了實驗基礎(chǔ)。

惡臭假單胞菌；甲苯；克??；原核表達(dá)

苯（benzene）、甲苯（toluene）、乙苯（ethylbenzene）和二甲苯（xylene）等單環(huán)芳烴化合物，縮寫為BTEX，是一類重要的環(huán)境污染物，廣泛來源于石油冶煉、農(nóng)藥生產(chǎn)、印染化工等工農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)、運輸?shù)雀鱾€過程。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且對人體的中樞神經(jīng)具有急性危害作用，其一旦進(jìn)入環(huán)境，不會自行消失，對環(huán)境和人類健康造成極大威脅。目前，國內(nèi)外對BTEX的研究主要集中在兩個方面：一是環(huán)境污染的降解研究，這部分多數(shù)以BTEX泄漏對地下水、土壤造成的污染為研究對象，進(jìn)而研究生物凈化修復(fù)技術(shù)；二是BTEX的高靈敏度分析方法技術(shù)研究[1-5]。在BTX的生物降解研究中，常利用質(zhì)粒載體構(gòu)建生物反應(yīng)器，但由于質(zhì)粒的遺傳具有相對的獨立性，經(jīng)過幾代的培養(yǎng)，很可能丟失，導(dǎo)致生物反應(yīng)器失效；進(jìn)入環(huán)境的質(zhì)粒也可能污染其他的菌種，易造成潛在的環(huán)境風(fēng)險性；而直接從環(huán)境中篩選的分解菌對生長環(huán)境要求高，適應(yīng)性差，生長增殖速度慢，不利于工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用。因此將降解酶基因整合至無降解能力但易生長的細(xì)菌（如大腸桿菌）染色體，構(gòu)建降解BTX的生物傳感器，以此來實現(xiàn)對污染物的降解，無疑是一種安全、穩(wěn)定、高性價比的解決方案。

本研究以具有降解甲苯的菌株——惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）為研究對象，對參與降解甲苯的生物酶基因——甲苯雙加氧酶（toluene dioxygenase，TOL）基因和鄰苯二酚1，2雙加氧酶（catechol 1，2-dioxygenase，CAT）基因進(jìn)行分子克隆、鑒定后進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，為后續(xù)構(gòu)建降解甲苯的生物反應(yīng)器提供前期準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：惡臭假單胞菌（命名為惡臭假單胞菌WZ-1，由本實驗室提供），分離于環(huán)境水源并已經(jīng)初步生化鑒定；大腸桿菌DH5a，由本實驗室提供。

1.1.2 試劑：Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PCR反應(yīng)試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pMD 19-T Vector、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）。

1.1.4 引物：用于擴增TOL基因的上游引物T1：5’-ATGATTGATTCAGCCAACAGAGCCG-3’，下游引物T2：5’-CTAGAAGAAGAAGAAACTGAGGTTATTGGCCAG-3’，目的片段長度為564 bp。為構(gòu)建TOL-pET28a重組質(zhì)粒，分別在引物T2 5’端加Nde I酶切位點及保護性堿基，在引物T1 5’端加Xho I酶切位點（CTCGAG）及保護性堿基。擴增CAT基因的上游引物C1：5’-ATGACCGT GAAAATTTCCCACAC-3’，下游引物C2：5’-TCAGCCCCTCC TGCAACGC-3’，目的片段長度936 bp。

1.2 方法

1.2.1 惡臭假單胞菌WZ-1降解甲苯能力的初步鑒定：配置MS培養(yǎng)基：①配制緩沖體系和鐵劑：KH2PO40.1809 g、K2HPO40.0339 g、（NH4）2SO40.1650 g，加雙蒸水充分溶解并定容至100 mL；準(zhǔn)確稱取FeSO4（NH4）2SO4·6H2O 0.0784 g至50 mL離心管中，加水充分溶解后定容至20 mL；取1 ml配置的鐵劑加到100 mL的緩沖體系中，搖勻后高壓滅菌待用；②配置微量成分：準(zhǔn)確取CaCl20.03 g、MgSO40.2 g、MnSO4·H2O 0.06 g分別置于三個50 mL離心管中，并分別加水充分溶解后定容至20 mL，上述三管溶液經(jīng)高壓滅菌后備用；③各取1 mL高壓滅菌后的CaCl2、MgSO4、MnSO4·H2O在無菌條件下加到已經(jīng)高壓的緩沖體系中，配制成MS培養(yǎng)基。

惡臭假單胞菌30 ℃ 200 r/min的搖床過夜培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基中，次日分別取20μL的惡臭假單胞菌菌液于含100、200、400、800μL甲苯的200 mL MS液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，并記錄24 h內(nèi)MS培養(yǎng)基惡臭假單胞菌液OD600值。

1.2.2 惡臭假單胞菌WZ-1 TOL基因和CAT基因的克?。壕昊蚪MDNA的制備：菌株于LB固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落重懸于100μL雙蒸水中，加熱煮沸后，降溫，于4 ℃冰箱中保存，以備用。

PCR擴增（20μL）：10×Ex Taq Buffer（含MgCl2）2μL、dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）2 μL、Ex Taq酶（5 U/μL）0.1μL、菌株基因組DNA 1μL、引物（10μmol/L）0.2μL，滅菌水補足20 μL。擴增條件為94 ℃ 5 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min共 35個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化。

PCR產(chǎn)物克?。耗康臈l帶經(jīng)電泳切膠回收后與pMD19-T質(zhì)粒16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用LB/Amp/X-Gal/IPTG培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆。提取TOL-pMD19-T重組質(zhì)粒和CAT-pMD19-T重組質(zhì)粒用PCR進(jìn)行驗證，并經(jīng)測序分析鑒定（由大連寶生物公司測序部完成）。

1.2.3 構(gòu)建TOL-pET28a重組質(zhì)粒及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：PCR擴增（20μL）：10×Ex Taq Buffer 2μL、dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）1.5μL、Ex Taq酶（5 U/μL）0.1μL、上述重組質(zhì)粒TOL-pMD19-T 1μL、引物（10μmol/L）各1μL、MgCl21.5μL，滅菌水補足20μL。擴增條件為94 ℃ 5 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min共 35個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化。

PCR產(chǎn)物克?。簲U增上述TOL-pMD19-T重組質(zhì)粒上的TOL基因。分別用限制性內(nèi)切酶XholI和NedI雙酶切PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，膠回收后16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，用LB/Kana培養(yǎng)基篩選陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒雙酶切進(jìn)行驗證，并測序鑒定。

上述陽性克隆菌培養(yǎng)于含Kana（1:1000）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)過夜，次日取10 mL菌液于1L LB培養(yǎng)基，37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8，加IPTG 400μM進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液，經(jīng)超聲裂解后，做SDS-PAGE電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 惡臭假單胞菌在含不同濃度甲苯的MS培養(yǎng)基中的生長情況 經(jīng)初步培養(yǎng)鑒定，本實驗室保存的該株惡臭假單胞菌（WZ-1），生長條件較為嚴(yán)苛，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需30 ℃培養(yǎng)48 h。在無機鹽培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）中培養(yǎng)幾乎不生長，而在含有不同濃度甲苯的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h生長情況良好，但在培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)生長停滯（見圖1）。

圖1 惡臭假單胞菌在含不同濃度甲苯的MS培養(yǎng)基中的生長情況

2.2 TOL基因和CAT基因的克隆和鑒定 經(jīng)PCR擴增及序列測定鑒定，從該惡臭假單胞菌基因組中獲得TOL基因和CAT基因。經(jīng)T-A克隆后篩選陽性克隆，將該克隆進(jìn)行質(zhì)粒測序以及經(jīng)BLAST比對分析后證實獲得TOL-pMD-19-T重組質(zhì)粒和CAT-pMD-19-T重組質(zhì)粒，結(jié)果見圖2-3。

圖2 TOL基因和CAT基因PCR擴增結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒TOL-pET28a酶切鑒定 提取TOL-pET28a重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果見圖4，并經(jīng)測序分析鑒定。

圖3 TOL-pMD-19-T重組質(zhì)粒和CAT-pMD-19-T-重組質(zhì)粒測序后序列比對結(jié)果

圖4 重組質(zhì)粒TOL-pET28a-TOL酶切鑒定

2.4 重組TOL在大腸桿菌中的表達(dá) 結(jié)果見圖5。

圖5 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果

3 討論

在過去幾年中，隨著人們對苯系物污染的重視程度的提高以及科學(xué)研究的深入，有關(guān)苯系污染物的檢測和治理已引起了極大關(guān)注[6-23]，其中利用模式生物對特定苯系物反應(yīng)的生物檢測和治理更受研究人員的關(guān)注[15-23]。至今，已經(jīng)有多種生物反應(yīng)器用于芳香族污染物的檢測[15-20]。

本實驗室已從環(huán)境水源中分離到菌株，經(jīng)初步生化鑒定為惡臭假單胞菌，命名為Pseudomonas sp.WZ-1（惡臭假單胞菌WZ-1），經(jīng)過進(jìn)一步的分子分型和進(jìn)化樹繪制，發(fā)現(xiàn)該亞型與惡臭假單胞菌NPO-JL-67（Pseudomonas sp. NPO-JL-67）具有相近的親緣性，為一種新發(fā)現(xiàn)的惡臭假單胞菌亞型。為驗證該亞型是否具備降解苯系物的能力，我們以甲苯為底物，利用惡臭假單胞菌在含甲苯的無機鹽培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）中是否利用甲苯的生長實驗結(jié)果為依據(jù)，若菌株能有效生長，則證明其能夠降解甲苯并利用其降解產(chǎn)物作為碳源以維持生長狀態(tài)；若生長情況差或者不生長，則說明該菌株在無營養(yǎng)供給的無機鹽培養(yǎng)基中無法利用甲苯，即無降解甲苯的能力。本菌株在不同含量甲苯的無機鹽培養(yǎng)基中生長情況良好，但在培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)生長停滯或稍有下降趨勢，可能由于在培養(yǎng)基中的甲苯已被完全消耗所致，該結(jié)果提示，惡臭假單胞菌WZ-1具備降解甲苯的能力，因此可以作為克隆降解甲苯生物酶基因的生物材料。

由于為新分離的菌株，本研究參考了NCBI中提供的惡臭假單胞菌F1全基因組的序列信息，設(shè)計引物，經(jīng)過PCR擴增、產(chǎn)物T-A克隆并測序后證實從該惡臭假單胞菌WZ-1中順利獲得兩種酶的基因，即TOL基因和CAT基因，該結(jié)果也證明該菌株可能與惡臭假單胞菌F1的序列存在高度同源性。

TOL是苯、甲苯及苯酚在降解途徑中的第一步關(guān)鍵酶，本研究中將該酶基因克隆至表達(dá)載體pET28a中，獲得陽性克隆并轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)電泳鑒定在體外獲得大量的TOL，但由于其表達(dá)于包涵體，其活性有待進(jìn)一步鑒定。

獲取目的基因是開展基因工程的重要步驟。本實驗成功獲得了用于降解甲苯的TOL基因和CAT基因，并經(jīng)測序證實，該成果為后續(xù)重組克隆的構(gòu)建，以及利用模式生物對苯系物的生物降解建立了實驗基礎(chǔ)。

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Cloning and expression of the genes of key enzymes in toluene degeneration

YANG Kai，MIAO Xiaoyan，CHEN Qiongsi，ZHANG Tingting，YE Wei，LU Jianxin.
School of Laboratory Medicine，Wenzhou Medical College，WenZhou，325035

Objective:To construct biosensor for the degeneration of toluene，the enzymes genes from Pseudomonas putida were cloned and expressed.Methods:A strain of Pseudomonas putida isolated from the water previously was cultured in MS medium for 24 h to identify the ability of degeneration of toluene firstly. Primers were designed according to toluene dioxygenase and catechol 1，2-dioxygenase gene sequence. PCR was performed as the template of gDNA from the Pseudomonas putida，T-A cloning as followed. Positive colonies were identified by restriction enzyme reactions and sequencing. Toluene dioxygenase gene was inserted to pET28a vector and the recombinant protein was expressed by IPTG induction.Results:This strain of Pseudomonas putida was proved high ability of degeneration of toluene. From its gDNA，acquirement of the two important genes in degeneration of toluene were demonstrated， and toluene dioxygenase gene was induced high level of expression in vivo.Conclusion:In this study，we complete in obtaining toluene dioxygenase and catechol 1，2-dioxygenase gene sequence from pseudomonas putida and inducing the expression of toluene dioxygenase，which is significant for further construction of biosensors.

Pseudomonas putida；toluene；clone；prokaryotic expression

Q781；Q786

A

1000-2138（2012）06-0556-05

2012-03-28

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃）（2010R413013）；浙江省教育廳科研基金資助項目（Y20080 4470）。

楊凱（1990-），男，云南曲靖人，本科生。

葉薇，講師，Email：yewei80@gmail.com。

丁敏嬌）

·論 著·