王文琪, 張 毅,, 劉夢俠, 吳志昊, 王麗娟, 訾 珺, 關(guān) 健, 尤 鋒

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 青島 266109; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071;3. 山東海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002)

許氏平鲉4個(gè)野生群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析

王文琪1, 張 毅1,2, 劉夢俠3, 吳志昊2, 王麗娟2, 訾 珺2, 關(guān) 健3, 尤 鋒2

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 青島 266109; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071;3. 山東海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002)

利用18對微衛(wèi)星引物分析了榮成灣群體1、榮成灣群體2、即墨群體和龍口群體共4個(gè)許氏平鲉(Sebastes schlegeli)野生群體的遺傳多樣性。結(jié)果表明：4個(gè)群體的平均有效等位基因數(shù)分別為3.1、2.7、2.8和2.7, 平均期望雜合度分別為0.590、0.540、0.552和0.491, 平均多態(tài)信息含量分別為0.577、0.495、0.538和0.528。4個(gè)許氏平鲉群體均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平, 但也都存在雜合子缺失現(xiàn)象。Χ2檢驗(yàn)顯示, 4個(gè)群體中大部分微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。群體間Fst值為0.04,說明遺傳變異主要存在于群體內(nèi), 群體間的遺傳分化程度較低。該研究結(jié)果將為許氏平鲉種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用以及人工增殖提供理論參考。

許氏平鲉(Sebastes schlegeli); 野生群體; 微衛(wèi)星標(biāo)記; 遺傳多樣性

許氏平鲉(Sebastes schlegeli), 又稱黑, 俗稱黑石鱸, 黑寨魚, 是近海常見的暖溫性底層魚類。其肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 生長快速, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是中國北方海域重要的經(jīng)濟(jì)魚種, 在海外市場也有一定銷路[1]。對于許氏平鲉, 目前已進(jìn)行過有關(guān)基礎(chǔ)生物學(xué)[2]、消化生理[3]、營養(yǎng)攝食[4]、環(huán)境脅迫[5]、分子免疫[6]及性別分化[7]等方面的研究, 但是對許氏平 鲉群體遺傳多樣性的研究還很少, 特別在分子水平上, 僅見Yoon等[8]利用RAPD分析許氏平鲉和朝鮮平 鲉(S.koreanus)的群體遺傳差異, 劉麗娟等[9]利用等位酶研究了山東4個(gè)野生群體和1個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。由于近10年近海漁場環(huán)境的巨大變遷, 造成近海漁業(yè)資源進(jìn)一步衰退, 勢必對該物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此研究許氏平鲉的群體遺傳多樣性水平, 了解其種質(zhì)資源狀況, 對于合理開發(fā)利用許氏平鲉資源, 保持其可持續(xù)利用具有重要意義。

微衛(wèi)星 DNA(Microsatellite DNA)標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性、重復(fù)性好、共顯性等特性, 在動(dòng)物的種群遺傳分析、親本鑒定、基因組作圖、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳育種中具有優(yōu)于其他標(biāo)記的明顯優(yōu)勢[10]。近年來也越來越多地應(yīng)用到魚類的群體遺傳分析、育種的研究中。如Sekino等[11]利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記分析了日本沿海7個(gè)牙鲆(Paralichthys olivaceus)群體, 說明日本沿海牙鲆的群體結(jié)構(gòu)不容樂觀。Kumagai 等[12]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對中日沿海的 7個(gè)三線鱸(Parapristipoma trilineatum)群體進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示中日群體之間存在著較大的遺傳分化, 中國的兩個(gè)群體也表現(xiàn)出很大的遺傳分化, 然而日本的群體間無遺傳分化。有關(guān)許氏平鲉的研究, 僅見韓國學(xué)者An等[13]和日本學(xué)者Yoshida等[14]進(jìn)行的微衛(wèi)星標(biāo)記分離及其雜合度分析的報(bào)道。作者從上述 2篇文獻(xiàn)中篩選獲得的20對引物中選取18對引物, 對山東榮成灣、青島 即墨和煙臺(tái)龍口 4個(gè)許氏平鲉野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平進(jìn)行了研究, 以期為許氏平鲉種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用以及良種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所分析的4個(gè)許氏平鲉群體分別是榮成灣群體1(SSRT)、榮成灣群體2(SSRC)、即墨野生群體(SSJM)和龍口野生群體(SSLK)。SSRC于2009年5月在山東榮成灣近岸海域垂釣所得, 共22尾,平均全長18.92 cm ±3.30 cm; SSRT是同年8月在榮成灣靠近外海的海域采用底拖網(wǎng)所得, 共30尾,平均全長18.61 cm ±3.55 cm; SSLK為5月由山東煙臺(tái)龍口附近海域垂釣所得, 共 13尾, 平均全長6.42 cm ±0.73 cm; SSJM則是5月在山東青島即墨附近沿海垂釣所得, 共 30尾, 平均全長 13.88 cm±1.52 cm。

1.2 基因組DNA的提取

基因組DNA采用高鹽法[15]提取, 經(jīng)Beckman DU 650型紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度后, 用無菌雙蒸水將模板稀釋到20 mg/L, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成

從 An等[13]和 Yoshida等[14]文獻(xiàn)中選取了 18對引物, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, 引物的相關(guān)信息見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增和結(jié)果記錄

擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25 μL, 其中包括：50 ng的模板 DNA, 1×Buffer緩沖液, 100 μmol/L 的 dNTPs, 0.4 μmol/L的引物, 1.0 mmol/L的Mg2+, 1U的Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為94℃變性5 min, 然后94℃ 50 s,退火50 s, 72℃延伸50s, 35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖電泳檢測后, 4℃保存?zhèn)溆谩?%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 電壓為5V/cm。電泳完畢后銀染檢測。

表1 實(shí)驗(yàn)所用18對微衛(wèi)星標(biāo)記的核心序列、退火溫度及其引物序列Tab. 1 Core repeats, annealing temperatures and primer sequences of the 18 microsatellite DNA loci used in the study

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 POPGEN32軟件計(jì)算等位基因數(shù)(number of alleles,A)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(obsevered heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、遺傳偏離指數(shù)(D)、群體遺傳分化指數(shù)(Fst)和Nei's遺傳距離。用 Arlequin進(jìn)行 AMOVA分析, 根據(jù) Botstein等[16]的方法計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)。有關(guān)計(jì)算公式如下：

多態(tài)信息含量：

其中,pi和pj分別表示第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率,m為等位基因數(shù)。

D =(He-Ho) /He;

Ho=雜合子觀察數(shù)/觀察個(gè)體總數(shù);

He= 1-ΣPi2,Pi為該位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因的頻率。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增結(jié)果和等位基因頻率

用這18對微衛(wèi)星引物對山東4個(gè)許氏平鲉群體進(jìn)行了遺傳變異分析, 部分?jǐn)U增圖譜如圖1。每個(gè)位點(diǎn)在不同群體中的等位基因頻率及其他遺傳參數(shù)見表2。在4個(gè)群體中, Kss18A位點(diǎn)所有個(gè)體均表現(xiàn)為單態(tài)性。其余17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)2～10個(gè)。

2.2 群體內(nèi)的遺傳變異

這 4個(gè)群體的平均期望雜合度、平均觀測雜合度、平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)和平均多態(tài)信息含量等指標(biāo)見表3、表4。平均有效等位基因數(shù)分別為 3.1(SSRT)、2.8(SSJM)、2.7(SSRC)、2.7(SSLK), 平均期望雜合度在0.540～0.590范圍內(nèi)。4個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量最高的是 SSRT, 為0.577; 最低的是SSRC, 為0.495。4個(gè)群體都表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。Χ2檢驗(yàn)顯示, 除 Kss18位點(diǎn), 在SSRT、SSJM、SSLK群體中有13個(gè)位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡, SSRC群體中有14個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。從遺傳偏離指數(shù)(D)看出, 大多數(shù)位點(diǎn)在4個(gè)群體中表現(xiàn)為雜合子缺失。

2.3 群體間的遺傳變異

AMOVA分析結(jié)果表明, 群體間的遺傳變異占總遺傳變異的4%, 群體內(nèi)的遺傳變異占總遺傳變異的96%(表5), 這表明4個(gè)群體間的遺傳分化較弱。表6、表7分別列出4個(gè)群體相互間的遺傳相似性、遺傳距離和遺傳分化指數(shù)。由表6可見, 最大遺傳距離在SSRT和SSLK之間, 為0.135; 最小遺傳距離在SSRC和SSLK之間, 為0.017。群體間Fst值均小于0.05。4個(gè)許氏平鲉群體間沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化,群體間的遺傳分化程度較低。

3 討論

微衛(wèi)星DNA由于具有在基因組中廣泛而隨機(jī)分布、多態(tài)性高、共顯性標(biāo)記、可重復(fù)性好、容易檢測等優(yōu)點(diǎn), 已經(jīng)成為分子系統(tǒng)學(xué)、種群遺傳學(xué)及生態(tài)學(xué)研究中最重要的分子標(biāo)記之一。群體的遺傳多樣性, 是物種適應(yīng)多變的環(huán)境條件, 維持長期生存和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。本研究中對許氏平鲉4個(gè)群體遺傳多樣性水平進(jìn)行了研究。各群體內(nèi)遺傳變異程度如平均多態(tài)信息含量(PIC)由大到小依次為SSRT(0.577)、SSJM(0.538)、SSLK(0.528)、SSRC(0.495)。Botstein等[16]首先提出了衡量基因變異程度的多態(tài)信息含量指標(biāo), 他們認(rèn)為當(dāng)PIC＞0.5時(shí), 該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn); 0.25＜PIC＜0.5時(shí), 該位點(diǎn)為中度多態(tài)性位點(diǎn);PIC＜0.25時(shí), 為低度多態(tài)性位點(diǎn)。許氏平鲉4個(gè)群體的PIC差異不大, 都在0.5左右, 表明它們的遺傳變異程度總體上處于一個(gè)較高的水平, 遺傳多樣性較為豐富, 選擇潛力大。

圖1 4 個(gè)許氏平鲉群體部分個(gè)體在微衛(wèi)星標(biāo)記Ssc69位點(diǎn)的電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis pattern of microsatellite markers amplified by Ssc69 locus from partial individuals in four stocks of Sebastes schlegeli

表2 4個(gè)許氏平鲉群體18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率Tab. 2 Allele frequencies of 18 microsatellites loci among four stocks of Sebastes schlegeli

這4個(gè)群體的平均期望雜合度(He)在0.447～0.590, 平均為 0.53, 其與 Yoshida等[14]用 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析的日本海域許氏平鲉期望雜合度(He=0.31～0.95)和An等[13]利用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析韓國沿海許氏平鲉的期望雜合度(He=0.072～0.897)基本相符。在其他海洋魚類中, Norris等[17]對大西洋鮭(Salmo salar)的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測得到平均雜合度為 0.70, Zatcoff等[18]得到不同群體博氏喙鱸(Mycteroperca bonaci)的平均雜合度為 0.637～0.876,DeWoody等[19]對12種海洋魚類進(jìn)行了微衛(wèi)星分析,得到的平均雜合度為0.77。由此可見, 海洋魚類普遍具有較高的雜合度水平, 但本研究 4個(gè)許氏平鲉群體的平均雜合度為 0.53低于上述各種海洋魚類, 也發(fā)現(xiàn)這 4個(gè)群體在大多數(shù)位點(diǎn)都存在雜合子缺失現(xiàn)象。究其原因, 可能是許氏平鲉是一種巖礁性魚類,不進(jìn)行長距離的洄游[20], 相對狹小的生活環(huán)境, 會(huì)使其不能進(jìn)行更大范圍的基因交流, 導(dǎo)致其在一定區(qū)域內(nèi)有近交情況, 從而降低了其遺傳變異。

表3 4個(gè)許氏平鲉群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 3 Genetic diversity value in four S. schlegeli stocks

表4 18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)、遺傳偏離指數(shù)和H-W檢測Tab. 4 Number of alleles(A), genetic deviation index(D), and H-W of the 18 microsatellite loci assessed for the four S.schlegeli stocks

表5 4個(gè)許氏平鲉群體的AMOVA分析結(jié)果Tab. 5 AMOVA analysis of the four S.schlegeli stocks

表6 許氏平鲉4個(gè)群體的遺傳相似性和遺傳距離Tab. 6 Genetic identity and distance among four S.schlegeli stocks

表7 許氏平鲉4個(gè)群體的Fst值Tab. 7 Fst values of pairwise comparison among 4 S.schlegeli stocks

作者通過各位點(diǎn)Fst的分析, 發(fā)現(xiàn)來自群體內(nèi)的遺傳變異是96%, 來自群體間的遺傳變異只有4%。通過不同群體Fst值的配對比較以及群體間的遺傳距離和遺傳相似性, 總體說明了 4個(gè)群體間的遺傳分化程度較低。

所有自然資源保護(hù)計(jì)劃的最終目的就是為了防止過度捕撈的物種滅絕[21], 環(huán)境受人類活動(dòng)的影響變化越來越快, 因此必須要保持動(dòng)物自身的遺傳適應(yīng)力。群體的遺傳多樣性越高, 對環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng), 進(jìn)化的潛力也越大。人工增殖放流計(jì)劃也是一種自然資源的保護(hù)計(jì)劃, 所以保護(hù)現(xiàn)有的野生群體的遺傳多樣性, 就要保持其較高的雜合度和基因豐富度[22]。本研究所分析的 4 鲉個(gè)許氏平 群體都具有豐富的遺傳多樣性, 而且其群體間低程度的遺傳分化, 使得榮成灣放流許氏平鲉的放流魚種可以用即墨、龍口、榮成灣任何一個(gè)地方的野生種群來作為親本進(jìn)行繁育。但是在人工增殖放流過程中要保持較高的群體遺傳多樣性需要一個(gè)合理的養(yǎng)殖管理方法。繁育過程中應(yīng)當(dāng)保證親本的更新, 避免近交影響,能夠定期對養(yǎng)殖放流種群做遺傳結(jié)構(gòu)的評(píng)估, 避免因放流種群遺傳多樣性下降而導(dǎo)致自然資源中多樣性的降低。作者利用微衛(wèi)星標(biāo)記得到的 4個(gè)許氏平鲉群體的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)為種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用提供理論參考, 也能為大規(guī)模的人工增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。

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Microsatellite analysis of genetic diversity in four wild stocks of black rockfishSebastes schlegeli

WANG Wen-qi1, ZHANG Yi1,2, LIU Meng-xia3, WU Zhi-hao2, WANG Li-juan2, ZI Jun2, GUAN Jian3, YOU Feng2
(1. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China; 2. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Shandong Provincial Mari-culture Institute, Qingdao 266002, China)

Mar, 11, 2011

Sebastes schlegeli; wild stock ; microsatellite DNA ; genetic variation

The genetic diversity of four wild stocks of black rockfishSebastes schlegeliincluding Rongcheng stock 1, Rongcheng stock 2, Jimo stock and Longkou stock, was investigated using 18 microsatellite DNA loci. The results showed that the mean effective numbers of alleles(Ne) were 3.1, 2.7, 2.8 and 2.7, respectively. The values of mean expected heterozygosity(He) were 0.590, 0.540, 0.552 and 0.491, respectively. And the values of mean polymorphism information content(PIC) were 0.577, 0.495, 0.538 and 0.528, respectively. These four stocks had abundant genetic diversity, but most loci were also found to be significantly deviated from HWE in which heterozygote absence was apparent according to the results of chi-square test (P＜0.05). Genetic differentiation and hierarchical partition of genetic diversity were evaluated byFst, which indicated high values of variation within four stocks and low levels of genetic variation among stocks (Fst=0.04). The results would provide basic data for the conservation and utilization of naturalS.schlegelibreeds, and for its artificial releasing.

Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)01-0010-07

2011-03-11;

2011-05-22

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200805069)

王文琪(1970-), 女, 山東萊陽人, 博士, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究, 電話：0532-86080565, E-mail：wenqiwang@qau.edu.cn; 王文琪和張毅對該論文的貢獻(xiàn)相當(dāng); 尤鋒, 通信作者, E-mail：youfeng@qdio.ac.cn

致謝：本研究所分析的榮成灣底拖網(wǎng)群體樣品(SSRT)的采集得到中國科學(xué)院海洋研究所線薇薇老師、李文龍老師的幫助, 謹(jǐn)此一并致謝。

譚雪靜)