王秀秀, 章 軍

(1. 福建省陸海界面生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廈門大學 環(huán)境與生態(tài)學院, 福建廈門 361005; 2. 廈門大學 生命科學學院,福建廈門, 361005)

基于LC-MS/MS技術對藍藻Gloeobacter violaceusPCC 7421細胞膜的蛋白質組學研究

王秀秀1, 章 軍2

(1. 福建省陸海界面生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廈門大學 環(huán)境與生態(tài)學院, 福建廈門 361005; 2. 廈門大學 生命科學學院,福建廈門, 361005)

Gloeobacter violaceusPCC 7421是一種在進化上很古老的無類囊體藍藻, 由于光合作用電子傳遞鏈與呼吸系統(tǒng)在其細胞質膜上共存, 這兩個系統(tǒng)可能會共享一些元件, 為研究其光合作用系統(tǒng)結構的獨特之處, 應用高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術對其細胞膜蛋白進行蛋白質組學分析。經鑒定發(fā)現(xiàn),G. violaceus的細胞質膜上具有PSⅠ、PSⅡ和細胞色素b6等光合作用關鍵蛋白, 同時具有呼吸作用過程中的關鍵酶1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、F0F1- ATP酶α和β亞基、細胞分裂蛋白、硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運蛋白、青霉素結合蛋白以及多種藥物受體ABC轉運蛋白。由此可知,G. violaceus的細胞質膜不僅能夠同時進行光合作用和呼吸作用, 且營養(yǎng)鹽運輸等轉運功能也同時存在。G. violaceus的全基因數據分析顯示其基因序列具有獨特性, 其蛋白注釋相對比較少, 因此其蛋白功能的研究需要更多數據的支持。

Gloeobacter violaceusPCC 7421; LC-MS/MS; 細胞質膜

蛋白質組學是近年來在海洋生物中的研究熱點,在細菌[1]、貝類[2]、節(jié)肢動物[3]和赤潮藻類[4]方面都有廣泛的應用。Gloeobacter violaceusPCC 7421是一種古老的無類囊體自養(yǎng)藍藻, 16S rDNA分子發(fā)育樹分析表明, 它是藍細菌與葉綠體在分枝之后最早的生物[5]。它具有一系列的獨一無二的特性：它沒有類囊體膜, 而且顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)光合作用元件定位在其細胞質膜上[6], 其細胞質膜不僅是細胞與外界進行物質交換的半透性屏障, 還是其光合作用的場所。由于光合作用電子傳遞鏈與呼吸系統(tǒng)在其細胞質膜上共存, 這兩個系統(tǒng)可能會共享一些元件[7], 例如質體醌(PQ)等, 且兩種系統(tǒng)的電子傳遞鏈可能重疊[8]。因此該藻細胞質膜蛋白質種類及其定位的選擇必然具有其重要的生物學意義, 其光合作用系統(tǒng)的結構和功能必然有其獨特之處。因此進行G. violaceus細胞質膜蛋白的蛋白質組學分析是十分有意義的。

高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用 (LC-MS/MS) 技術是近年來廣泛使用的高通量高靈敏度的蛋白質組學分析方法, 在定量分析和低豐度蛋白的分離分析方面, LC-MS/MS比起雙向電泳技術為基礎的凝膠水平的分離分析更加便利和準確[9]。因此, 我們運用LC-MS/MS技術對G. violaceus細胞質膜上蛋白進行蛋白質組學研究, 用以揭示其細胞質膜上相關蛋白質的種類, 為今后的蛋白功能和定位研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

G. violaceusPCC 7421由廈門大學生命科學學院微藻分子與基因工程實驗室保存。將G. violaceusPCC 7421按1∶50的比例接種于新鮮配制的BG-11培養(yǎng)基中, 28 ℃靜置培養(yǎng), 24 h連續(xù)光照, 光照強度為 80 μmol/(m2·s), 到對數生長期時收集藻體用于提取膜蛋白。

實驗中使用的所有水均為Milli-Q水, 所有試劑均為分析純, 乙腈(ACN)為色譜純, 胰酶(Sigma公司)為測序純。

1.2 膜蛋白的提取

將200 mL對數期藻細胞于Beckman 高速冷凍離心機中離心收集, 條件為8 000g, 4 ℃, 離心時間為 10 min。離心結束后去上清, 用無菌的生理鹽水(0.85%)重懸沉淀后再次離心收集, 條件同上。離心結束后取沉淀, 將沉淀在緩沖液中進行超聲波破碎,當鏡檢后 99%的細胞無細胞結構后停止。細胞破碎后, 離心去除未破碎的細胞, 離心條件為12 000g, 4℃, 離心時間 10 min, 離心結束后取上清即為細胞全蛋白樣品。

膜蛋白的提取方法依據Gutmann的方法進行[10]。在 Beckman超速離心機中, 將全細胞蛋白樣在100 000g, 4 ℃, 離心時間為40 min的條件下離心,離心結束后將上清盡量去除干凈, 取沉淀即為膜蛋白粗樣。將膜蛋白粗樣在20 mL預冷的10%三氯乙酸-丙酮中沉淀,于–20 ℃冰箱中沉淀過夜,去除色素等干擾組分。期間數次漩渦振蕩, 盡量使沉淀在三氯乙酸-丙酮中分布均勻。沉淀結束后離心收集沉淀,條件為12 000g, 4 ℃, 離心時間20 min。離心結束后用預冷的丙酮重懸沉淀, 再次離心取沉淀, 條件同上。多次重復直至上清為無色, 即認為色素等干擾物已經去除干凈, 將沉淀在超凈工作臺中吹干, 即為膜蛋白樣品。

1.3 酶切

將干燥的蛋白溶解于200 μL的含有6 mol/L鹽酸胍, 50 mmol/L Tris溶液中(pH 8.3), 然后加入2 μL的1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)。混合物在37 ℃孵育2.5 h, 然后加入 10 μL的0.8 mol/L 碘乙酸(IAA)溶液, 避光室溫孵育40 min。在此之后, 高速冷凍離心機內在11 000g, 6℃, 90 min條件下將蛋白溶液通過3 K超濾管(Millipore公司), 并交換到50 μmol/L碳酸氫氨溶液中(pH 8.5), 并加入 15 μg胰蛋白酶在37 ℃孵育過夜。未酶切的蛋白和胰蛋白酶通過10 K超濾管去除(條件同上)。消化的多肽混合物在冷凍離心干燥后溶解在 20 μL 0.5%的甲酸(FA)溶液中, 其中10 μL用于質譜分析。

1.4 LC-MS/MS方法鑒定膜蛋白

液相色譜-電噴霧線性離子阱質譜(LC-ESI-MS)分析使用LTQ (ThermoFisher Scientific)質譜儀。色譜分析柱為75 μm ID, 10 cm長的C18反相柱, 流動相為 A：0.1% FA/H2O, B：0.1% FA/ACN, 分流前流速為120 μL/min, 分流后為 2 μL/min。ESI針電壓為 3.0 kV,歸一化碰撞能量為 35%。數據采集使用數據依賴模式, 包括一個完整的 MS掃描, 核質比從 400到1 800, 收集10個最高豐度的離子進行碰撞誘導解離,得到二級譜圖用于多肽鑒定。動態(tài)排除參數為：重復計數2次, 重復時間30 s, 排除期120 s。

1.5 數據庫搜索

串聯(lián)質譜數據采用 SEQUEST算法, 在G.violaceusPCC 7421全基因組FASTA數據庫中進行搜索, 假陽性率為≤1%。

1.6 蛋白功能注釋以及亞細胞定位網址

蛋白功能Uniprot數據庫中注釋, 蛋白亞細胞定位在PSORTb(版本3.0.2)網站搜索。

2 結果與分析

2.1 LC-ESI-LTQ質譜譜圖

G. violaceus的LC-ESI-LTQ譜圖如圖1所示, 從圖中可以看出,G. violaceus蛋白分離清晰, 信號強度較高, 蛋白分離效果良好, 且存在數個高豐度蛋白。

圖1 G. violaceus PCC 7421膜蛋白液相色譜圖Fig. 1 LC-ESI-LTQ maps of membrane proteins of G.violaceus PCC 7421

2.2 質譜鑒定結果

經過數據庫搜索, 共鑒定出 36種(38個)G.violaceus蛋白, 見表1所示。

2.3 蛋白亞細胞定位

分析得到的蛋白的亞細胞定位如圖2所示, 經過在線程序 PSORTb(版本 3.0.2)的亞細胞定位分析,分離得到的蛋白中 54%的蛋白為質膜蛋白(21個),31%的蛋白為胞漿蛋白(11個), 15%的蛋白為未知定位的蛋白(6個)。

表1 G. violaceus PCC 7421膜蛋白LC-ESI-LTQ鑒定結果Tab. 1 LC-ESI-LTQ results of membrane proteins of G. violaceus PCC 7421

在質膜蛋白中包含PSⅠ的A2蛋白, PSⅡ的D1蛋白, 細胞色素b6, 全部的ATP相關蛋白(3個)、細胞分裂蛋白、硝酸鹽轉運蛋白、信號轉導蛋白以及聚酮合成酶和糖基轉移酶等。胞漿蛋白中主要包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶、核苷酸磷酸化酶、RNA合成酶和核糖體亞基。

圖2 已鑒定蛋白亞細胞定位分布圖Fig. 2 Subcellular localizations of the identified proteins

2.4 蛋白動能分類

根據蛋白功能分類, 將蛋白分為 11類, 如圖3所示：

圖3 細胞質膜已鑒定蛋白功能分布圖Fig. 3 Functions of the identified membrane proteins

如圖3所示, 已鑒定的蛋白中根據功能分類, 主要為光合作用相關蛋白(7個)、碳固定相關蛋白(1個)、轉運蛋白(5個)、ATP酶(3個)、蛋白質合成相關蛋白(4個)、核酸合成相關蛋白(2個)、脂類合成相關蛋白(1個)、信號轉導相關蛋白(2個)、細胞分裂相關蛋白(1個)、其他功能(5個)以及未知功能蛋白(8個)。

3 討論

雙向電泳是蛋白質組學最早使用的分離技術,但是由于它對堿性端的蛋白分離效果比較差, 特別是對低豐度蛋白的分離效果有限, 更加凸顯了LC-MS/MS方法的優(yōu)勢, 如圖1所示, LC-ESI/LTQ質譜的結果比較理想, 分離得到的蛋白強度較高, 分離效果較好, 且鑒定得到的蛋白其等電點從4.62～9.84, 分子量從9 kD到221 kD, 分布非常寬泛(表1), 這種方法的精度高且對堿性蛋白的分離效果好, 再加上二級質譜對低豐度蛋白具有很好的信號放大作用, 操作簡便, 且省時省力, 因此利用LC-MS/MS法在藍藻膜蛋白的分離鑒定方面非?？尚小Ｓ捎贚C-MS/MS的方法是在蛋白分離之前酶解,免除了在割膠時可能帶進去污染的問題, 但也造成了分析質譜結果時的假陽性增高的缺點, 因此在數據分析時必須嚴格設定搜庫條件, 假陽性率為≤1%,提高數據可信度。

藍藻中含量最大的蛋白是藻藍蛋白, 從圖3可以看出, 使用超速離心的方法可以富集膜蛋白, 去除大部分藻藍蛋白。提取得到的G. violaceusPCC 7421的膜蛋白中經鑒定膜蛋白的比率為 54%, 主要是光合作用相關蛋白、ATP酶以及轉運蛋白等。胞漿蛋白占所提取蛋白中的 31%, 主要是與核酸和蛋白質合成過程有關的蛋白, 同時也有部分胞漿蛋白是與光合作用相關的蛋白, 如 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶, 這一酶蛋白本身是沒有跨膜結構的,它們很可能是在執(zhí)行功能時附在膜上而同時被分離出來。

2003年 Nakamura的基因組數據報道[7],G.violaceus具有4 324個可編碼蛋白的基因, 其中僅有1 301個基因與其他藍藻具有相似性, 并且其中610個基因為藍藻特有基因(在已知基因組數據的藍藻,包括Synechocystissp. PCC 6803,Anabaenasp. PCC 7120和Thermosynechococcus elongatusBP-1中), 高達一半的基因是未知功能的基因。因此,G. violaceus的基因注釋比較困難。根據G. violaceus的液相譜圖來看, 我們提取到的蛋白種類豐富, 但全范圍二級質譜后匹配得到的蛋白只有38個(36種), 比預想的數據低, 且 15%的蛋白為假想蛋白(6/38), 這一結果可能是由于G. violaceus的基因信息比其他模式藍藻少, 又兼其基因序列的獨特性, 它的全基因組序列注釋工作比較困難, 因此可供查詢的蛋白質序列庫的信息不全, 因此對G. violaceus基因和蛋白質序列的生物信息學研究和實驗需要更大力度地開展, 用以解開這一古老生物的蛋白編碼之謎。

2003年G. violaceusPCC 7421的全基因組序列的公布, 對G. violaceus的具有光合系統(tǒng)的質膜的研究成為一個熱點。Inoue等[11]發(fā)現(xiàn)G. violaceus的PSⅠ中含有 9個亞基, 其他藍藻含有 12個亞基, 其亞基的數量較其他藍藻相比有所減少, 并具有獨特的PsaZ亞基。同時, 其PSⅠ第二個電子受體是甲基萘醌類, 而不是常見的葉綠醌[12]。Mimuro[12]發(fā)現(xiàn)在–196℃下,G. violaceus的光合作用復合物缺乏PSⅠ的葉綠素熒光, PSⅡ是獨特的可以利用光能氧化兩分子水產生一份子氧氣的蛋白復合物。Koyama等[13]發(fā)現(xiàn)雖然G. violaceus的PSⅡ系統(tǒng)的蛋白氨基酸序列有所變化, 并且在細胞質膜上進行, 但是最基本的水氧化反應過程是高度保守的。Sicora等[14]研究發(fā)現(xiàn)G. violaceus具有5個PSⅡ的D1蛋白(psbA)基因,并且會調動至少其中 3個支持其 PSⅡ的修復循環(huán),并且可以快速清除沒有光活性的D1蛋白。我們的結果同時鑒定到了PSI的A2蛋白和PSⅡ的D1蛋白,沒有鑒定到PsaZ蛋白, 可能是因為蛋白濃度豐度較低。也只鑒定出一種D1蛋白, 可能是由于鑒定得到的肽段是5種 D1蛋白的相同功能結構域中的蛋白,鑒定得到5種不同的D1蛋白可能需要具體的分離純化得到PSⅡ蛋白復合體再進行蛋白的種類鑒定。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是與呼吸作用有關的酶。它是光合作用中卡爾文循環(huán)里催化第一個主要的碳固定反應, 將大氣中游離的二氧化碳轉化為生物體內儲能分子, 它所催化的反應是無機態(tài)的碳進入生物圈的主要途徑[15]。茄呢酰二磷酸酯合酶的催化產物輔酶 Q(ubiquinone)結合蛋白質的輔基(或輔酶)部分, 在呼吸鏈上不斷地被氧化和還原, 起著傳遞氫(遞氫體)或電子(遞電子體)的作用[16]。核糖體蛋白鑒定出30S小亞基一個蛋白, 硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運蛋白、ABC轉運蛋白等典型質膜蛋白也有得到鑒定。

綜上所述, 我們的鑒定結果包含了G. violaceus光合作用系統(tǒng)、呼吸作用系統(tǒng)和電子傳遞鏈的關鍵蛋白, 以及藻藍蛋白和別藻藍蛋白等光捕獲蛋白亞基, 核糖體亞基, 轉運蛋白亞基, 以及有關蛋白質合成、核酸合成、脂類合成、信號轉導、細胞分裂和代謝相關的多種功能的蛋白, 為今后G. violaceus膜蛋白質組學的研究進行了初步的探索, 有待于今后開展更深入的研究解決這些問題。

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LC-MS/MS analysis of plasmic membrane proteins inGloeobacter violaceusPCC 7421

WANG Xiu-xiu1, ZHANG Jun2
(1. Fujian Provincial Key Laboratory of Coastal Ecology and Environmental Studies,College of the Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Collge of life Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Apr.,10,2012

Gloeobacter violaceusPCC 7421; LC-MS/MS; plasma membrane

Gloeobacter violaceus, which lacks thylakoids, is the earliest branched cyanobacteria in the phylogenetic tree. Photosynthetic and respiratory systems coexist in its plasma membrane. To study of feature of the protein location of photosynthetic and respiration systems, we isolated and used LC-MS/MS to analyze plasma membrane proteins ofG. violaceusPCC 7421. The results showed this species had critical photosynthetic reaction center complexes proteins, such as photosystem II protein D1, photosystem I P700 chlorophyllaapoprotein A2, cytochrome b6, and allophycocyanin beta subunit. The ribulose bisophosphate carboxylase was also identified. The ATP synthesis subunits, cell division proteins and nitrate transporters were identified at the same time. Therefore, the plasma membrane not only could carry out photosynthesis and respiration, the nutrient transport and other transport function also existed. Because of the low similarity of its gene with other organisms, many proteins were difficult to be annotated.

Q946 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)09-0039-06

2012-04-10;

2012-07-11

福建省自然科學基金項目(2010J01232)

王秀秀(1982-), 女, 河北張家口人, 博士研究生, 主要研究方向為分子生態(tài)學, E-mail：xiuxiuwang0420@126.com; 章軍, 通信作者, 副教授, 研究方向為微藻基因工程及蛋白質組學, E-mail：jzhang@xmu.edu.cn

張培新)