王躍華，林抗雪，劉益麗，馬良良，代 勇，徐世軍，王曉蓉

(1.成都大學生物產業(yè)學院，四川成都 610106;2.成都恩威集團(投資)有限公司，四川成都 610041)

0 引言

1989年，Langis等首次報道了玻璃化法超低溫保存的方法，其原理是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護劑組成的玻璃化溶液中，在足夠快的降溫速度下，經高濃度玻璃化溶液作用后的組織細胞內外及其溶液因缺乏冰晶形成的條件而進入到無定型的玻璃化狀態(tài)，并以這種玻璃化狀態(tài)在低溫下保存，此狀態(tài)下由于沒有冰晶對細胞的損傷，因而植物材料的存活率大大提高［1］.此方法免去了傳統(tǒng)冷凍方法中復雜的程序性降溫等步驟，具有設備簡單、程序簡化和凍存效果好等優(yōu)點［2］.在利用玻璃化法保存植物材料的過程中，玻璃化溶液脫水處理時間的掌握以及對保存材料的選擇是影響植物材料保存效果的關鍵因素.玻璃化脫水處理時間的長短將決定著保存材料是否充分脫水以及玻璃化溶液是否充滿組織細胞間，進而影響材料的保存效果.由于植物的基因類型，抗凍性，以及器官、組織、細胞的生理狀態(tài)等因素對超低溫保存的效果有較大影響［3］.因此，在對植物進行超低溫保存前，對保存材料的選擇極其重要.本研究將玻璃化法首次應用于川貝母芽、愈傷組織和鱗莖的超低溫保存中，以期找到最適宜于用玻璃化法保存的川貝母材料.

1 材料與方法

1.1 材料選擇

實驗材料來自成都大學生物產業(yè)學院組培室，分別選取繼代培養(yǎng)15 d的優(yōu)質川貝母芽、愈傷組織和鱗莖作為實驗材料.

1.2 溶液配制

(1)100%玻璃化溶液II.分別量取238 mL甘油、134.5 mL乙二醇、136.5 mL DMSO，再稱取171 g蔗糖，于1 000 mL燒杯中依次用蒸餾水溶解后定容.

(2)60%玻璃化溶液II.將100%玻璃化溶液II與MS液體培養(yǎng)基附加0.5 mol/L蔗糖的溶液以體積比為60∶40進行混合.

1.3 預培養(yǎng)

選取實驗材料后將其接入MS+30 g/L蔗糖+ 5%二甲基亞砜的固體培養(yǎng)基中，于室溫為20℃，光照強度1 200 lx，12 h/d的條件下預培養(yǎng)6 d.

1.4 玻璃化法保存

取預培養(yǎng)后的實驗材料，將其切為3 mm×3 mm× 2 mm大小后裝入10 mL冷凍管中，每管裝入4塊.在常溫下加入60%玻璃化溶液II，裝載25 min后，再于2℃下加入100%玻璃化溶液II，分別脫水處理30 min、45 min、60 min、75 min，然后直接投入液氮中保存.

1.5 凍后材料的解凍與洗滌

在液氮中保存5 d后將冷凍材料取出，立即放入40℃恒溫水浴鍋中進行快速解凍.完全解凍后用MS液體培養(yǎng)基附加1.0 mol/L蔗糖的溶液進行浸泡洗滌，每次10 min，重復處理3次后吸出洗滌液并用蒸餾水沖洗干凈.

1.6 凍后材料TTC值測定

洗滌完畢后，將材料置于小燒杯中，加入已用磷酸緩沖溶液調節(jié)pH值為7的0.4%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液，常溫黑暗條件下染色18 h.充分染色后吸去TTC溶液，用蒸餾水洗滌數次，濾紙吸水后加入10 mL 95%乙醇置于40℃恒溫水浴鍋中進行TTF的提取，直至材料無色，取上清液用UV-1100型紫外分光光度計在485 nm下測定其吸光值.上述每個處理重復測定3次，取其平均值，計算凍后材料細胞的相對存活率，

2 結果與討論

2.1 不同脫水時間對川貝母芽保存效果影響

植物體的芽為植物中尚未充分發(fā)育和成長的枝條，是枝條的雛型.組織培養(yǎng)中的芽可通過進一步生長分化成為無根苗，誘導生根后即可成為完整的無菌苗.川貝母芽保存后的存活率如表1所示.

表1 川貝母芽保存后的存活率

表1數據顯示，當川貝母芽的脫水時間在30～60 min之間時，隨著脫水時間的逐漸增加，其保存后川貝母芽的存活率也逐漸增大，并在60 min時達到最大，存活率可達51.20%.其后，隨著脫水時間的繼續(xù)增加，保存材料的存活率呈現出明顯下降的趨勢，脫水時間增加到75 min時，其保存后材料的存活率僅為22.22%.

在實驗中，采用玻璃化溶液對保存材料進行適當的脫水處理，從而使材料適度脫水，在此條件下快速冷凍材料組織，細胞內外將進入無定型的玻璃化狀態(tài)，細胞內無冰晶的形成，材料相對存活率也將大大提高.進一步分析可看出，脫水時間為60 min保存后的川貝母芽的存活率達到最高，說明此時玻璃化溶液已充滿其細胞內外，材料細胞處于最適度的生理脫水狀態(tài)，此時材料最宜于保存.由于用玻璃化溶液脫水處理材料的過程中，高濃度的玻璃化溶液與細胞內液形成了較高滲透勢，細胞內的水分將逐漸脫出，同時組成玻璃化溶液中一些滲透性的物質分子如二甲基亞砜、乙二醇、甘油能很快滲透到組織細胞內與水分子結合從而增大了溶液的粘性弱化水的結晶過程，而玻璃化溶液中一些非滲透性的物質如蔗糖進入組織細胞間隙的溶液中，也降低了溶液的冰點.

2.2 不同脫水時間對川貝母愈傷組織保存效果影響

愈傷組織是植物組織培養(yǎng)中最為常見的物質，具有生長速度快并可分化成為各種組織和器官的潛力，但愈傷組織在長時間的繼代過程中細胞易發(fā)生染色體的畸變.川貝母愈傷組織保存后的存活率如表2所示.

表2 川貝母愈傷組織保存后的存活率

表2數據顯示，采用不同脫水時間處理的玻璃化法保存川貝母愈傷組織，其存活率的變化規(guī)律與川貝母芽基本一致，其最佳脫水處理時間也為60 min，但在此條件下保存的愈傷組織其存活率為80.81%，明顯高于芽.

進一步分析表明，由于愈傷組織材料較芽體而言，其細胞分化程度更低，細胞分裂活動更旺盛，因而愈傷組織處于有絲分裂前后的細胞也更多.通常，處于有絲分裂前后的細胞具有細胞質黏稠、細胞壁薄、液泡化程度低等適宜超低溫保存的特點［4］，因而使得材料在冷凍保存過程中細胞內不易形成冰晶，大大地提高了冷凍保存材料的抗凍能力.

2.3 不同脫水時間對川貝母鱗莖保存效果影響

鱗莖是川貝母植物的藥用部位，是著名的川產地道藥材之一，具有止咳化痰、清熱潤肺等功效.同時，鱗莖也是川貝母植物無性繁殖的重點器官.川貝母鱗莖保存后的存活率如表3所示.

表3 川貝母鱗莖保存后的存活率

表3數據顯示，在采用玻璃化法保存川貝母鱗莖的過程中，用玻璃化溶液進行不同脫水時間處理后，冷凍保存后的川貝鱗莖存活率存在較大差異.隨著脫水時間的增加其存活率不斷升高，60 min時達到最高為48.50%，但超過60 min后其存活率明顯下降，75 min時僅為21.04%，為3種保存材料中最低的.

2.4 實驗結果分析

從實驗測得的3種未凍存材料的TTC平均值大小看，未凍存愈傷組織的TTC值最高為2.230，未凍存芽的TTC值2.156，未凍存鱗莖的TTC值最低為1.730.由于TTC值的大小可反應細胞內脫氫酶的活性，而脫氫酶的活性可表征組織細胞生命活動的旺盛程度，生命活動越旺盛，細胞的有絲分裂也相對越活躍，其處于有絲分裂前后的細胞也就越多，進而其組織細胞的抗凍能力越強.由于鱗莖的TTC值相對最低，因此其細胞抗凍能力也就相對最弱，凍存后材料的存活率也就相對最低.所以，在用玻璃化法保存植物材料時對保存材料的選擇是影響材料保存效果最為關鍵的因素.

3 結語

在超低溫保存植物種質材料的過程中，保存材料的選擇極為關鍵.趙艷華等［5］在超低溫保存蘋果離體莖尖時發(fā)現，材料的生理狀態(tài)對莖尖存活率的影響甚至比保存過程中處理因素的影響更大.本研究選取了繼代15 d的優(yōu)質川貝母芽、愈傷組織和鱗莖作為實驗材料，實驗得出3種保存材料的最佳脫水時間均為60 min時，并且此時愈傷組織的存活率為80.81%，明顯高于芽的存活率51.20%和鱗莖的存活率48.50%.本研究也進一步證實了，分化程度越低的材料因其處于分裂期前后的細胞越多，抗凍能力也越強，保存后材料的存活率也越高的結論.

此外，玻璃化溶液脫水處理時間是保存種質資源的決定性因素.本研究對玻璃化法保存川貝母的芽、愈傷組織和鱗莖的脫水處理時間進行了篩選.實驗結果表明，不同的脫水處理時間對凍存后材料的存活率有明顯影響.

［1］梁宏，王起華.植物種質的玻璃化超低溫保存［J］.細胞生物學雜志，2005，27(1):43－45.

［2］覃靈華，劉華英.玻璃化法超低溫保存植物種質資源及其研究進展［J］.作物雜志，2008，24(3):20－23.

［3］劉云國，王曉云.果樹種質源超低溫保存研究進展［J］.生命科學研究，2001，5(3):227－232.

［4］王君暉，黃純農.玻璃化法——園藝作物莖尖和分生組織超低溫保存的新途徑［J］.園藝學報，1994，21(3):277－287.

［5］趙艷華，吳永杰，陳霜瑩.包埋干燥超低溫保存蘋果離體莖尖［J］.園藝學報，1988，15(1):93－95.