郭興鳳，吳欣欣，薛園園，魯亞楠

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

堿性蛋白酶水解豌豆蛋白及其產(chǎn)物抗氧化活性研究

郭興鳳，吳欣欣，薛園園，魯亞楠

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

采用堿性蛋白酶（Alcalase）水解豌豆蛋白，對(duì)不同條件下制備的豌豆蛋白酶水解產(chǎn)物DPPH·清除率進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化酶水解條件，得到最佳酶解工藝條件為：酶解溫度56.5℃，酶解時(shí)間3.2 h，pH6.1，加酶量3.0%，底物濃度3.0%，在此條件下，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除率為47.83%.

堿性蛋白酶；豌豆蛋白質(zhì)；酶水解；響應(yīng)面方法；DPPH自由基

0 引言

抗氧化劑對(duì)抵御人體內(nèi)活性氧危害起著重要的作用，活性氧是人體內(nèi)細(xì)胞有氧呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)[1].適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低人體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，有助于機(jī)體抵御疾病.目前具有抗氧化活性的物質(zhì)有很多種，肽類(lèi)物質(zhì)是最有前途的一種，可通過(guò)蛋白質(zhì)酶解技術(shù)進(jìn)行制備.近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者已從多種食物蛋白如大豆蛋白、肉類(lèi)蛋白、乳酪蛋白，海洋蛋白、廢棄蛋白資源等的酶解液中分離出具有抗氧化活性的肽片段[2].

豌豆是我國(guó)種植的豆類(lèi)之一，主要用作制備淀粉，對(duì)豌豆蛋白酶水解的研究較少，而將豌豆蛋白酶解得到生物活性肽是進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用豌豆蛋白的途徑之一.本研究采用制備淀粉的副產(chǎn)物豌豆蛋白粉為原料，用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）對(duì)豌豆蛋白酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，為豌豆蛋白多肽的開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 原料和試劑

豌豆蛋白粉：蛋白質(zhì)含量67.38%，山東健源食品有限公司；堿性蛋白酶：標(biāo)稱(chēng)活力單位2.4 AU/g，Novo Nordisk；其他試劑均為分析純.

1.2 主要設(shè)備

722s可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CHA—S氣浴恒溫振蕩器：金壇市華鋒儀器有限公司；SHZ—88水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；HH—S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠.

1.3 分析方法

1.3.1 豌豆蛋白粉中各組分的測(cè)定

粗蛋白含量的測(cè)定參照GB/T5009.5-2010；水分的測(cè)定參照GB/T5009.3-2010；灰分的測(cè)定參照GB/T5009.3-2010；粗脂肪測(cè)定參照 GB/T5009.3-2010；NSI值的測(cè)定參照GB5511-85附錄.

1.3.2 豌豆蛋白的酶水解

稱(chēng)取一定量的豌豆蛋白粉，加入預(yù)熱的緩沖溶液和蛋白酶，混勻，放入氣浴恒溫振蕩器中振蕩水解，水解完成后90℃加熱10min滅酶，之后立即冷卻至室溫.將酶解液定容，過(guò)濾，取濾液測(cè)定DPPH·的清除率.每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±偏差表示.

1.3.3 DPPH·清除能力測(cè)定方法

參照Teng等[3]的方法.配制濃度為l×l0-4mol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液，避光保存.取2 mL樣品與2 mL DPPH·無(wú)水乙醇溶液混合，振蕩均勻，室溫避光反應(yīng)30min，517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i.空白組以等體積無(wú)水乙醇溶液代替DPPH·溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液.DPPH·的清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度.

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶水解溫度、pH值、酶水解時(shí)間3個(gè)因素為自變量（分別以A、B、C表示），以酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)因素水平的選取根據(jù)單因素試驗(yàn)確定.

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白粉的組成（表1）

表1 豌豆蛋白粉的主要組成成分 %

2.2 各因素對(duì)豌豆蛋白酶水解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

2.2.1 加酶量（E/S）對(duì)豌豆蛋白酶解產(chǎn)物 DPPH·清除率的影響

在底物濃度為 6.0%，pH值為 7.0，酶解溫度50.0℃，酶解時(shí)間3.0 h的條件下，考察加酶量對(duì)DPPH·清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 加酶量（E/S）對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)加酶量在1.0%～3.0%的范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，酶解產(chǎn)物的自由基清除率不斷增大，加酶量在3.0%時(shí)DPPH·清除率達(dá)到最大，加酶量超過(guò)3.0%以后，隨著加酶量的增加酶解產(chǎn)物自由基清除率反而降低.這是因?yàn)樵谝欢ǖ牡孜餄舛认拢?dāng)加酶量較低時(shí)，酶可能被飽和，能與底物全部結(jié)合，故加酶量越高，水解效果相應(yīng)就會(huì)越好，清除率越高.隨著加酶量的繼續(xù)增加，反應(yīng)體系中酶濃度過(guò)高，導(dǎo)致酶與酶之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，以致抗氧化肽的生成量減少[4].或者酶解過(guò)程中產(chǎn)生了促氧化物質(zhì)，從而降低了酶解產(chǎn)物的清除率[5].

2.2.2 底物濃度對(duì)豌豆蛋白酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

在加酶量為3.0%，pH 7.0，酶解溫度50.0℃，酶解時(shí)間3.0 h的條件下，考察底物濃度對(duì)DPPH·清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

由圖2可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.0%時(shí)，DPPH·清除率最大，之后又隨著底物濃度的增加而降低.當(dāng)?shù)孜餄舛认鄬?duì)較低時(shí)，酶分子與豌豆蛋白結(jié)合速度較慢，酶水解產(chǎn)物的DPPH·清除率較低.隨著底物濃度增加，酶分子與豌豆蛋白接觸機(jī)會(huì)增多，水解易于進(jìn)行，故水解產(chǎn)物的DPPH·清除率增加.但當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.0%～6.0%的范圍內(nèi)增加時(shí)，DPPH·清除率反而下降，這是因?yàn)殡S著底物濃度的繼續(xù)增大，底物分散困難，較多的底物相互包埋[6]，且反應(yīng)產(chǎn)物濃度過(guò)大抑制水解的繼續(xù)進(jìn)行，反應(yīng)難度加大，因此豌豆蛋白酶解物的DPPH·清除率降低.

2.2.3 pH值對(duì)豌豆蛋白酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

在加酶量為3.0%，底物濃度為3.0%，酶解溫度50.0℃，酶解時(shí)間3.0 h的條件下，考察pH值對(duì)DPPH·清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 pH值對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

由圖3可以看出，當(dāng) pH值小于6.4時(shí)，DPPH·清除率隨著pH值的增大而增大，pH值超過(guò)6.4以后，DPPH·清除率隨著pH值的增大而逐漸下降.這是由于每種蛋白酶都有不同的最佳pH值范圍，且受底物的影響，偏離了這個(gè)范圍，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行.同時(shí)改變pH值大小，溶液中H+濃度發(fā)生改變，最終影響堿性蛋白酶分子和底物的解離狀態(tài)[7]，影響酶解的效果，導(dǎo)致清除率變化.

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)豌豆蛋白酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

在加酶量為3.0%，底物濃度為3.0%，pH值為6.4，酶解溫度50.0℃的條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

由圖4可以看出，使用堿性蛋白酶水解，酶解時(shí)間在1.0～3.0 h內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，清除率增加，酶解時(shí)間超過(guò)3.0 h以后，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，清除率反而下降.DPPH·清除率在3.0 h處達(dá)到最大.這是因?yàn)榈鞍酌杆獾鞍踪|(zhì)通常是從蛋白質(zhì)分子的外部進(jìn)行水解，當(dāng)?shù)孜锖偷鞍酌噶窟_(dá)到一定時(shí)，蛋白質(zhì)將會(huì)逐步被水解成較小的肽段，而且特定的氨基酸殘基一般存在于強(qiáng)自由基清除率的肽段中，隨著水解的進(jìn)行，從蛋白質(zhì)序列上水解下來(lái)的強(qiáng)自由基清除率的肽段又被進(jìn)一步水解，從而喪失活性[8].

2.2.5 酶解溫度對(duì)豌豆蛋白酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

在加酶量為3.0%，底物濃度為3.0%，pH值6.4，酶解時(shí)間3.0 h的條件下，以DPPH·清除率為指標(biāo)，考察酶解溫度對(duì)DPPH·清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5.

由圖5可以看出，在酶解溫度45.0～55.0℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率顯著增加，在55.0℃時(shí)DPPH·清除率達(dá)到最大.這是因?yàn)闇囟容^低時(shí)水解速度較慢，因此在一定的溫度范圍內(nèi)，酶解速度隨著溫度的升高而增加.酶解溫度達(dá)到55.0℃之后，DPPH·清除率反而隨著酶解溫度的升高降低.出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是酶只有在特定的溫度下，才能保持最佳的活性構(gòu)象.酶解溫度過(guò)高時(shí)，酶分子吸收過(guò)多的能量，會(huì)引起酶分子結(jié)構(gòu)中次級(jí)鍵的解體，導(dǎo)致酶蛋白變性，從而使酶活性降低甚至喪失活性，所以酶解溫度達(dá)到55℃后，清除率反而降低.

圖5 酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH·清除率的影響

2.3 堿性蛋白酶水解豌豆蛋白條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定加酶量3.0%，底物濃度 3.0%，以酶解溫度（A）、pH 值（B）、酶解時(shí)間（C）為變量，酶解產(chǎn)物的 DPPH·清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)擬合因素和指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）尋求酶解最優(yōu)工藝參數(shù).試驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表2[9].

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

以DPPH·清除率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用如下函數(shù)表示：

Y=-268.06+3.54A+68.34B+4.89C-0.03A2-5.59B2-2.30C2-0.06AB+0.08AC+0.91BC（此方程為實(shí)際值方程），

式中：Y為DPPH·清除率；A為酶解溫度；B為pH值；C為酶解時(shí)間.

根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖6.

運(yùn)用Design-Expert 6.0軟件對(duì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，堿性蛋白酶水解豌豆蛋白回歸方程的方差分析如表3所示.

從表3可見(jiàn)，本試驗(yàn)所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性（p＜0.000 1）；B、A2、B2、C2對(duì)清除率的影響顯著，表明在堿性蛋白酶水解豌豆蛋白過(guò)程中，pH值、酶解溫度的二次方、pH值的二次方、酶解時(shí)間的二次方對(duì)清除率有顯著影響；失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著.回歸方程的決定系數(shù)為0.994 4，校正決定系數(shù)為0.984 4，說(shuō)明該模型能解釋98.44%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的1.56%不能用此模型來(lái)解釋?zhuān)f(shuō)明該模型擬合程度良好.

對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得出最佳的工藝條件為：酶解溫度56.5℃，酶解時(shí)間3.2 h，pH值為6.1，加酶量為 3.0%，底物濃度為3.0%，DPPH·清除率預(yù)測(cè)值為47.55%.采用以上所得DPPH·清除率最佳水解條件進(jìn)行水解，重復(fù)3次，測(cè)得堿性蛋白酶解物DPPH·的清除率（47.83±0.45）%，證明了最佳提取條件的可靠性.

3 結(jié)論

以堿性蛋白酶水解豌豆蛋白粉，響應(yīng)面方法優(yōu)化得到的堿性蛋白酶解物清除DPPH·清除率的最佳工藝條件為：酶解溫度56.5℃，酶解時(shí)間3.2 h，pH值為6.1，加酶量為3.0%，底物濃度為3.0%，在此條件下豌豆蛋白的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基的清除率（47.83±0.45）%.

表3 回歸方程的方差分析

圖6 響應(yīng)面曲面圖

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STUDY ON PEA PROTEIN HYDROLYSIS BY USING ALCALASE AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HYDROLYZATE THEREOF

GUO Xing-feng,WU Xin-xin,XUE Yuan-yuan,LU Ya-nan
（School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China）

In this paper,we used alcalase as catalyst to hydrolyze pea protein,and studied the DPPH·scavenging rate of the hydrolyzate of the pea protein prepared under different conditions.The hydrolysis conditions were optimized by response surface methodology on the basis of single factor experiments,and the optimized conditions were as follows:hydrolysis temperature 56.5℃,time 3.2 h,pH 6.1,alcalase content 3.0%(W/W),and substrate concentration 3.0%(W/V).Under the conditions,the DPPH·scavenging rate of the hydrolyzate was up to 47.83%.

alcalase； pea protein； enzymatic hydrolysis； response surfacemethodology； DPPH free radical

TS 201.1

B

CNKI:41-1378/N.20120208.0844.002

1673-2383（2012）01-0006-05

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120208.0844.002.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2012-2-8 08:44:47AM

2011-07-20

郭興鳳（1965-），女，河南封丘人，教授，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用.