李 強(qiáng) 黨誠(chéng)學(xué)

胃癌是常見的惡性腫瘤，目前胃癌手術(shù)后的預(yù)后不佳，嚴(yán)重危害著人類健康。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類核轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARα、PPARβ及PPARγ 3種亞型。近年來研究表明，PPARγ具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。PPARγ與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，目前研究較少。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌組織和正常切緣胃組織中PPARγmRNA的表達(dá)，并結(jié)合胃癌患者的臨床病理特征及生存資料，探討PPARγ mRNA在胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2004年5月～2010年5月陜西省腫瘤醫(yī)院就診的胃癌手術(shù)患者53例作為研究對(duì)象。胃癌標(biāo)本手術(shù)切除后立即取胃癌組織、正常切緣胃組織，快速放置在液氮罐中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ赴┙M織標(biāo)本及正常切緣胃組織均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。53例胃癌患者中，男性38例，女性15例；年齡33～67歲，中位年齡55歲。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC) 第6版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期27例，Ⅳ期5例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無轉(zhuǎn)移12例。所有患者均行根治性切除，術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后行2～6個(gè)周期輔助化療，中位化療周期數(shù)為4個(gè)周期。對(duì)53例胃癌患者進(jìn)行隨訪，手術(shù)治療時(shí)間作為生存的起始時(shí)間，隨訪結(jié)束時(shí)間作為終止時(shí)間，以死亡作為結(jié)局事件。結(jié)局事件發(fā)生的時(shí)間與起始時(shí)間之間的時(shí)間間隔定義為患者的生存時(shí)間。隨訪截止到2011年5月。采取電話和信件隨訪。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 采用RNAfast200試劑盒提取完整的RNA，按照Ferments(MBI)公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 PPARγ mRNA檢測(cè) 按 Realtime PCR Master Mix (ferments)試劑盒操作說明，在實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。以cDNA為模板擴(kuò)增PPARγ mRNA和β-actin基因。反應(yīng)體系SYBR Green Realtime PCR Master Mix(2×)12.5 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl，模板DNA 2 μl，加水至25 μl。PPARγmRNA擴(kuò)增引物：上游引物5’-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG -3’，下游引物5’-AGGACTCAGGGTGGTTCAGC-3’；β-actin擴(kuò)增引物：上游引物5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’,下游引物5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 用2-△△Ct法處理實(shí)時(shí)定量PCR所測(cè)數(shù)值(Ct值)，得出PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組；△Ct=△CtPPARγ-△Ctβ-actin。2-△△Ct≥2為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用配對(duì)t檢驗(yàn)分析胃癌組織和切緣正常胃組織中PPARγ mRNA表達(dá),獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析胃癌組織中PPARγ mRNA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Kaplan—Meier和log rank進(jìn)行生存分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ mRNA 在胃癌組織中的表達(dá)

胃癌組織中PPARγ mRNA表達(dá)水平為(3.14±2.80)，較切緣正常胃組織(1.03±0.27)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胃癌中PPARγ mRNA高表達(dá)30例，高表達(dá)率為56.6%；PPARγ mRNA低表達(dá)23例，低表達(dá)率為43.4%。

2.2 胃癌組織中PPARγ mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌組織中PPARγ mRNA表達(dá)量與胃癌的TNM分期有關(guān)(P=0.027)，與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及分化程度無關(guān)(P>0.05)(表 1)。

表1 胃癌組織中PPARγmRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PPARγ mRNA與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

53例胃癌患者平均中位生存時(shí)間為47個(gè)月，PPARγ mRNA高表達(dá)的胃癌患者中位生存時(shí)間為60個(gè)月，PPARγ mRNA低表達(dá)的胃癌患者中位生存時(shí)間為36個(gè)月。Kaplan-Meier曲線分析(圖1)。Log-rank檢驗(yàn)表明，PPARγ mRNA高表達(dá)患者的生存率高于低表達(dá)者(P=0.015)。

圖1 胃癌PPARγ mRNA不同表達(dá)水平組患者的生存曲線(月)

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤，2008年全世界新增胃癌患者，占全部腫瘤的7.8%[1]。目前，胃癌患者的主要治療手段是手術(shù)治療，但患者術(shù)后的生存期并不樂觀，其死亡率僅次于肺癌、肝癌，全球每年新發(fā)胃癌病例41%發(fā)生在中國(guó)；中國(guó)占全球每年胃癌死亡人數(shù)的35%[2]。

近年來,胃癌的分子生物學(xué)和發(fā)病機(jī)制的研究揭示了胃癌是1種異質(zhì)性腫瘤,腫瘤的個(gè)體化治療日益受到重視。傳統(tǒng)的胃癌預(yù)后指標(biāo)TNM分期，已無法滿足個(gè)體化治療的要求。

隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，過氧化物酶體增殖物激活受體( PPARs)與腫瘤的關(guān)系越來越引起人們的重視。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)，是一類核轉(zhuǎn)錄超家族,它對(duì)基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄作用，因而它調(diào)節(jié)著多種生理過程，在一些疾病中扮演著重要角色。它包括PPARα、PPARβ及PPARγ 3種亞型。它們分布在不同的組織中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和代謝平衡等多種生物功能。PPARγ是核受體超家族的成員，當(dāng)被配體激活并與維甲類X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體后，可以結(jié)合位于目標(biāo)基因上游的過氧化物酶增殖體反應(yīng)元件( peroxisome proliferating response element，PPRE)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

PPARγ在乳腺、結(jié)腸、肺、卵巢、前列腺，甲狀腺等多種組織中表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ活化后，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期等作用來發(fā)揮腫瘤的抑制效應(yīng)[3]。

目前對(duì)于PPARγ mRNA與胃癌的生物學(xué)特性及預(yù)后之間的關(guān)系研究較少。我們采用real-time PCR定量方法測(cè)定PPARγ mRNA在胃癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示PPARγ mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，與王麗萍[4]、Yao[5]報(bào)道的一致。我們的研究結(jié)果表明PPARγmRNA的表達(dá)量與TNM分期有關(guān)，和患者的性別、年齡、組織分化、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。以上研究結(jié)果提示：PPARγ與腫瘤的發(fā)生、腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。

我們通過對(duì)PPARγ mRNA表達(dá)量和胃癌手術(shù)后生存期的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ mRNA表達(dá)量高的患者中位生存期為60個(gè)月，PPARγ mRNA表達(dá)量低的患者中位生存期達(dá)36個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。國(guó)外學(xué)者在對(duì)結(jié)腸癌、肺癌、舌癌[6，7]的研究中發(fā)現(xiàn)PPARγ高表達(dá)腫瘤患者預(yù)后較低表達(dá)者好。這表明，PPARγ mRNA表達(dá)水平對(duì)判斷胃癌預(yù)后有重要的臨床意義，是1個(gè)有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。

PPAR-γ激動(dòng)劑在腫瘤細(xì)胞系中已經(jīng)顯示出抗腫瘤增殖作用[8，9]。研究表明PPARγ通過多種途徑發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)，主要包括:①阻滯細(xì)胞周期；②誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；③抑制炎癥反應(yīng)和血管生成；④抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床研究[10,11]也顯示接受PPARγ激活劑治療的患者，發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)低，提示PPARγ具有保護(hù)作用。

綜上所述，胃癌組織中PPARγ mRNA的表達(dá)與胃癌的分期和預(yù)后密切相關(guān)，PPARγmRNA在胃癌組織中的表達(dá)，有可能成為1個(gè)有用的預(yù)后指標(biāo)，對(duì)胃癌的發(fā)展和預(yù)后做出準(zhǔn)確的判斷，同時(shí)發(fā)揮化學(xué)預(yù)防和治療的作用，更好地進(jìn)行胃癌的個(gè)體化治療。

[1] Ferlay J，Shin HR，Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008〔J〕.Int J Cancer，2010，127(12):2893.

[2] 季加孚，季 鑫.胃癌治療的新進(jìn)展〔J〕.循證醫(yī)學(xué)，2011,11(2):82.

[3] Ondrey F.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma pathway targeting in carcinogenesis:implications for chemoprevention〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(1):2.

[4] 王麗萍,李洪亮,劉愛東,等.PPARγ和MMP-9在胃癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2010,50(32):50.

[5] Yao L，Liu F，Sun L,et al.Upregulation of PPARg in tissue with gastric carcinoma〔J〕.HYBRIDOMA，2010,29(4):341.

[6] Ogino S，Shima K，Baba Y,et al.Colorectal cancer expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG，PPARgamma)is associated with good prognosis〔J〕.Gastroenterology,2009,136(4):1242.

[7] Theocharis S，Klijanienko J，Giaginis C,et al.Peroxisome proliferator- activated receptor-γ in mobile tongue squamous cell carcinoma:associations with clinicopathological parameters and patients survival〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011,137(2):251.

[8] Blanquicett C，Roman J，Hart CM.Thiazolidinediones as anti-cancer agents 〔J〕.Cancer Ther，2008,6(A):25.

[9] 朱理輝，張 琍.PPARγ激活劑羅格列酮對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞周期及其PTEN表達(dá)的影響〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2006，21，(3)：238.

[10] Govindarajan R，Ratnasinghe L，Simmons DL,et al.Thiazolidinediones and the risk of lung，prostate，and colon cancer in patients with diabetes〔J〕.J Clin Oncology，2007,25(12):1476.

[11] Girnun GD，Chen L，Silvaggi J,et al.Regression of drug resistant lung cancer by the combination of rosiglitazone and carboplatin〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(20):6478.