王中煥 楚建軍 張福正 沈 玲 楊 雪

原發(fā)性肝癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，大多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，而介入治療對(duì)肝癌伴門脈癌栓患者效果不佳。放療是輔助治療肝癌的有效手段之一，近期， COX-2抑制劑塞來(lái)昔布在實(shí)體瘤腫瘤輔助治療中的作用引起研究人員的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在探討COX-2抑制劑塞來(lái)昔布聯(lián)合放療，對(duì)人肝癌細(xì)胞株huh-7凋亡及細(xì)胞周期的影響，以及塞來(lái)昔布對(duì)huh-7放療敏感性的影響，為提高肝癌的放療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌huh-7細(xì)胞株由國(guó)家人類基因組南方研究中心韓澤廣教授惠贈(zèng)。塞來(lái)昔布為輝瑞公司產(chǎn)品。DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶(TryPsin)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；放射治療設(shè)備為美國(guó)Varian公司的23EX電子直線加速器；FACS Vantage SE型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株huh-7細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM，含10%胎牛血清、青鏈霉素各100 μl/ml，NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2，培養(yǎng)于37℃、5%CO2濃度，飽和濕度培養(yǎng)箱中。Huh-7細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，一般48 h換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，一般按照1∶3的比例，每48～72 h傳代1次。將塞來(lái)昔布溶于(dimethylsulfoxide，DMSO)其中配置出濃度為100 μmol/L的母液，放入-20℃冰箱。然后用培養(yǎng)基稀釋到所需要的濃度，DMSO終濃度不超過0.1%。

1.2.2 MTT法測(cè)定塞來(lái)昔布對(duì)huh-7 細(xì)胞增殖的影響 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的huh-7細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。以每孔 5×103個(gè)細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板，24 h 后換液,加入不同濃度塞來(lái)昔布使其終濃度分別為6.25、12.5、25、50、75、100 μmol/ L。以未進(jìn)行藥物干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照組。每種濃度平行3個(gè)復(fù)孔，分別于加藥后24、48、72 h無(wú)菌條件下吸去上清，加入無(wú)血清的培養(yǎng)液100 μl/孔，并加入MTT 50 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔的液體，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩器上振蕩溶解 5～10 min，以空白對(duì)照調(diào)零，應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)儀，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)出各實(shí)驗(yàn)組的吸光度 A 值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。存活率=(藥物實(shí)驗(yàn)組A平均值/細(xì)胞對(duì)照組A平均值) ×100%； 抑制率(%)=1-存活率。

1.2.3 細(xì)胞的照射與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單細(xì)胞懸液，于接種24 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁，然后進(jìn)行不同處理，分為4組：①對(duì)照組：未接受藥物和照射處理；②藥物組：加入塞來(lái)昔布，使其終濃度為25 μmol/L；③單純照射組;④聯(lián)合組：加藥2 h后進(jìn)行照射。細(xì)胞照射：醫(yī)用直線加速器的6 MV-X射線照射，機(jī)架角180°,射野25 cm×24 cm，劑量率200 cGy/min，吸收劑量4 Gy。照射時(shí)將培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面朝下，周邊以封口膜封口，以保證細(xì)胞不被污染，培養(yǎng)瓶上做好分組標(biāo)記，瓶上下墊一塊1.5 cm厚的等效有機(jī)玻璃板，放療源到有機(jī)玻璃板面的距離為100 cm，4 Gy等中心照射后,繼續(xù)培養(yǎng)受照細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 處理48 h后收集細(xì)胞。收集過程：用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌2次后用500 μL PBS重懸，收集細(xì)胞數(shù)目約(1～5)×105個(gè)，加入預(yù)冷的70%冰乙醇1 ml，邊加邊用手輕微震蕩混勻，-20℃固定過夜。檢測(cè)時(shí)用冷PBS洗滌2次后，分別加入細(xì)胞周期試劑盒中的RNA酶和PI，按照說(shuō)明書的步驟操作后，將樣品經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，應(yīng)用流式細(xì)胞儀專用的試管收集標(biāo)本，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，并對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡檢測(cè)時(shí)收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度塞來(lái)昔布對(duì)huh-7細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用，而且隨著藥物濃度增高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率升高，表明其抑制作用具有時(shí)間及藥物濃度的依賴性(表1)。且塞來(lái)昔布從12.5 μmol/L至75 μmol/L，在同濃度下，作用72 h時(shí)抑制率明顯高于作用24、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表 1 MTT 法測(cè)定塞來(lái)昔布對(duì)huh-7肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：huh-7細(xì)胞的自發(fā)凋亡率極低，藥物組凋亡率顯著高于對(duì)照組，提示此濃度的塞來(lái)昔布促進(jìn)huh-7細(xì)胞凋亡；放療組凋亡率較對(duì)照組明顯提高，表明放療能夠誘導(dǎo)凋亡；聯(lián)合組凋亡率高于對(duì)照組，放療組與藥物組凋亡率比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，見表2。

表 2 作用48 h后各組huh-7細(xì)胞凋亡率情況

▲為與對(duì)照組比較，P<0.05；○為與藥物組比較，P=0.000；●為與放射組比較，P=0.000

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組均出現(xiàn)大小不一的凋亡峰，與對(duì)照組比較，藥物組G0/G1期細(xì)胞比例增大，S期細(xì)胞比例減小，而 G2/M變化不大；照射組G0/G1期細(xì)胞比例增大，S期細(xì)胞比例減小，而G2/M細(xì)胞比例增大；聯(lián)合組與藥物組比較，G0/G1期細(xì)胞比例減小，S期細(xì)胞比例增大，而G2/M期細(xì)胞比例增大；聯(lián)合組與放療組比較，G0/G1期細(xì)胞比例減小，S期細(xì)胞比例減小，而G2/M期細(xì)胞變化不大(表3)。

表3 作用48 h后各組 huh-7細(xì)胞周期情況

3 討論

有報(bào)道顯示[1]，COX-2在肝癌組織中表達(dá)，提示COX-2可能是腫瘤防治的1個(gè)新靶點(diǎn)[2]。塞來(lái)昔布(celecoxib)是用于臨床的COX-2選擇性抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度塞來(lái)昔布作用于肝癌細(xì)胞株huh-7細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有明顯抑制作用，并且隨著濃度的增高,作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用更明顯，呈一定的劑量時(shí)間依賴關(guān)系，因此，塞來(lái)昔布有可能對(duì)肝癌細(xì)胞的發(fā)展有抑制作用。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示，塞來(lái)昔布與放療均誘導(dǎo)凋亡，并且塞來(lái)昔布聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用，提示塞來(lái)昔布有提高放療敏感性，與馮文峰等研究結(jié)果相符[3]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示塞來(lái)昔布作用時(shí),G1期受到

阻滯,阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期,從而抑制細(xì)胞增殖，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的[4]相符。照射時(shí)G2期發(fā)生明顯阻滯與夏景光等[5]的研究結(jié)果相符。塞來(lái)昔布使對(duì)放療不敏感的S期細(xì)胞減少，影響細(xì)胞DNA的修復(fù)，可能是其放療增敏機(jī)制之一，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述，塞來(lái)昔布能提高人肝癌細(xì)胞株huh-7放療敏感性作用，其作用可能是通過協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期時(shí)相分布等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[1] Chi- Man Tang T，Tung- Ping Poon R.The significance of cyclooxygenase- 2 expression i n human hepatocellular carcinoma〔J〕.Biomed Pharmacother，2005，59(Suppl):311.

[2] 高雪芹,張維東.COX- 2 在腫瘤組織的表達(dá)及其化學(xué)預(yù)防靶點(diǎn)的意義〔J〕.中國(guó)公共衛(wèi)生，2002，18(2):249.

[3] 馮文峰，黃理金，漆松濤，等.放療誘導(dǎo)大鼠腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及敏感性的比較研究〔J〕.中華放療醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2004，24(2):111.

[4] Hu XM，Hirano T，Oka K.Arsenic trioxide induces apoptosis in cells of MOLT-4 and itsdaunorubicin-resistantcell line via deple-tion of intracellularglutathione，disruption ofmitochondrialmem-brane potential and activation of caspase-3〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,2003，52:47.

[5] 夏景光，李文建，魏 巍，等.3Gyγ射線對(duì)不同腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響〔J〕.核技術(shù)，2005，28(8):621.