劉 立，田 剛，宋 艷，孫德軍

(1．白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，2．吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長春 130021)

烏蘇里蝮蛇毒一種C-型凝集素相關(guān)蛋白的分離、純化及活性測定

劉 立1，田 剛1，宋 艷2，孫德軍2

(1．白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，2．吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長春 130021)

目的 從烏蘇里蝮蛇蛇毒中分離純化得到具有促凝血活性的C-型凝集素相關(guān)蛋白。方法 利用IDASepharose FF親和色譜作為獨(dú)立的蛋白分離純化手段，并且結(jié)合Sephadex G-100，Sephadex G-50凝膠過濾色譜從烏蘇里蝮蛇蛇毒中分離得到一個新的蛋白組分。結(jié)果 該組分經(jīng)還原和非還原SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示為均一的單一條帶，即C-型凝集素相關(guān)蛋白，相對分子質(zhì)量約為15．7 kD。結(jié)論 經(jīng)過一系列的分離和純化，能夠從烏蘇里蝮蛇蛇毒中提取到C-型凝集素相關(guān)蛋白組分。

烏蘇里蝮蛇蛇毒;C-型凝集素相關(guān)蛋白(CLRPs);分離純化;活性測定

長白山烏蘇里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)主要分布于我國東北部，以及朝鮮、俄羅斯的部分地區(qū)。蛇毒中組分復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)多肽、氨基酸、中性脂、游離單糖、磷酸、生物胺和核苷及微量金屬離子，其中蛋白質(zhì)和多肽是蛇毒的主要成分，占蛇毒干重的85% ～90%。

C-型凝集素相關(guān)蛋白(C-type lectin-related proteins，CLRPs)是蛇毒來源的C-型凝集素的重要組成部分。CLRPs家族中既含有α和β亞基以共價鍵形成的異源二聚體，也包括由多個異源二聚體(αβ)組成的相對分子質(zhì)量(Mr)較大的異源二聚體寡聚體，其中，α和β亞基結(jié)構(gòu)相似，由123～135個氨基酸組成，有40%的同源性，因而Mr極為相近，約為15 kD［1］。由于蛇毒來源的CLRPs，在空間結(jié)構(gòu)和生物功能上具有較為突出的特性，已成為近幾年蛇毒研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)了多種不同蛇毒來源的 CLRPs［2］，而長白山烏蘇里蝮蛇來源的CLRPs尚未見報道。

本實驗利用IDA-Sepharose FF親和色譜作為獨(dú)立的蛋白分離純化手段，并且結(jié)合Sephadex G-100，Sephadex G-50凝膠過濾色譜從烏蘇里蝮蛇蛇毒中分離得到一種新的CLRPs，為后續(xù)的研究工作和開發(fā)與利用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

長白山烏蘇里蝮蛇蛇毒(Gloydius ussuriensis snake venom)購于吉林磐石養(yǎng)蛇場，冷凍真空干燥后為黃色粉末。

IDA-Sepharose FF，Sephadex G-100，Sephadex G-50，Amersham Pharmacia公司;標(biāo)準(zhǔn) Mr(14．3 ～97．2 kD)蛋白marker、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250，美國Sigma公司。

HD-95-1核酸蛋白檢測儀，上海金達(dá)生化儀器廠;DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠;UV-802H紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司。

2 方法

2．1 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的分離純化及鑒定

稱取烏蘇里蝮蛇毒粗毒1 g溶于pH 8．0，0．05 mol/L的Tris-HCl緩沖液5 mL中，4℃透析除鹽，過夜。取透析過夜后的樣品，此時樣品應(yīng)為澄清淡黃色液體，上樣到用同樣的緩沖液平衡的IDA-Sepharose FF(2．5 cm×50 cm)親和色譜交換柱上，然后先用含0．02 mol/L 咪唑的 0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8．0)洗脫，再用 0．3，1．0 mol/L 咪唑-0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH為8．0)分級梯度洗脫，得到4個峰，SDS-PAGE電泳對各個峰所含蛋白進(jìn)行檢測，將峰Ⅳ收集并用30 kD截留量的超濾管超濾濃縮，濃縮樣品上樣到Sephadex G-100色譜柱(2．5 cm ×100 cm)，并用0．01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8．0)洗脫，得到2個峰，SDS-PAGE電泳對各個峰所含蛋白進(jìn)行檢測，將峰2收集，并用離心超濾管(30 kD)濃縮至5 mL，上樣到Sephadex G-50色譜柱(2．5 cm ×50 cm)，用 0．01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8．0)洗脫，得到1個蛋白主峰，利用 SDSPAGE電泳進(jìn)行鑒定。

2．2 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的Mr測定［3］

利用SDS-PAGE電泳測定Mr。根據(jù)各不同Mr蛋白質(zhì)Marker(14．3～97．2 kD)的Rf值推導(dǎo)出直線回歸方程，根據(jù)樣品的Rf值估算出樣品的Mr。

2．3 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的濃度測定［4］

利用考馬斯亮蘭染色法測定蛋白濃度。將考馬斯亮蘭G-250染液5 mL，分別加入到標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0．1 mL中，于595 nm波長處測吸光度值，求出直線回歸方程。取樣品溶液0．1 mL按1∶10稀釋后，測定吸光度值，計算出濃度。

2．4 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的纖維蛋白原凝固活性測定

取0．2%纖維蛋白原溶液200 μL，37℃水浴 2 min后，加入不同濃度的烏蘇里蝮蛇毒CLRPs(0．05～0．5 mg/mL)40 μL，記錄凝固所需時間。

2．5 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs對不同濃度纖維蛋白原凝固活性測定

將正常的新鮮血漿加熱到60℃，5 min后取出，3 000 r/min離心10 min，得到上層血清，其中基本不含有纖維蛋白原，用此血清將已知濃度的纖維蛋白原按一定比例稀釋，得到不同濃度的纖維蛋白原血漿。取不同濃度的纖維蛋白原血漿200 μL，分別加入0．5 mg/mL 烏蘇里蝮蛇毒 CLRPs 40 μL，觀察并記錄各組血漿凝固所需要的時間。

2．6 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的纖維蛋白原水解活性測定［5］

取0．5 mg/mL烏蘇里蝮蛇毒CLRPs溶液 120 μL，加入0．2%纖維蛋白原溶液600 μL，混勻，37 ℃水浴 2 min，于第 0，5，15，30 min 和 1，2，5，12，24 h分別取出80 μL，終止反應(yīng)，用不加樣品的0．2%纖維蛋白原溶液作為陰性對照。將上述各時間點(diǎn)取出的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定纖維蛋白原降解情況，T 為12．5%。

3 結(jié)果

3．1 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的分離純化及鑒定

烏蘇里蝮蛇毒粗提物經(jīng)IDA-Sepharose FF親和色譜，分離得到4個蛋白峰，標(biāo)記為PeakⅠ～Ⅳ(圖1)，采用SDS-PAGE電泳對各個蛋白峰進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)峰Ⅳ中含有烏蘇里蝮蛇毒CLRPs。將峰Ⅳ進(jìn)行Sephadex G-100凝膠過濾色譜后分離得到2個蛋白峰，分別記作Peak 1和2(圖2)，同樣方法檢測，發(fā)現(xiàn)Peak 2中含有烏蘇里蝮蛇毒CLRPs。將Peak 2進(jìn)行Sephadex G-50凝膠過濾色譜后，得到蛋白主峰，同樣方法進(jìn)行檢測，烏蘇里蝮蛇毒CLRPs呈單一條帶。

圖1 烏蘇里蝮蛇粗毒IDA-Sepharose FF親和色譜分離圖譜Fig．1 Affinity chromatography of Gloydius ussuriensis venom on IDA-Sepharose FF

3．2 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的電泳圖譜

將Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離后的含有烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的組分，經(jīng)還原和非還原條件SDSPAGE鑒定，電泳圖譜顯示，均呈單一條帶(圖4)。

圖2 PeakⅣ組分的Sephadex G-100凝膠過濾色譜分離圖譜Fig．2 Gel filtration of PeakⅣ on Sephadex G-100

圖3 Peak 2組分的Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離圖譜Fig．3 Gel filtration of Peak 2 on Sephadex G-50

圖4 非還原和還原SDS-PAGE分析烏蘇里蝮蛇毒CLRPs(T=15%)Fig．4 Non-reducing and reducing SDS-PAGE analysis of Gloydius ussuriensis venom C-type lectin-related protein by 15%SDS-PAGE

3．3 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的Mr

根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的相對位置，計算出Rf值，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=2．108 －1．165 X，其中X 為Rf值，Y為 Mr的對數(shù)，r=0．797 4。根據(jù)樣品Rf值由回歸方程計算出烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的Mr約為15．7 kD。

3．4 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的濃度

利用考馬斯亮蘭法，測得標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的濃度(C)與595 nm處的吸光度(A)值的關(guān)系，求出回歸方程為:C=0．415 7 A+0．017 1，r=0．998。將烏蘇里蝮蛇毒CLRPs溶液A值導(dǎo)入回歸方程，并計算出樣品濃度為1．025 mg/mL。

3．5 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的纖維蛋白原凝固活性

結(jié)果見表1。隨著烏蘇里蝮蛇毒CLRPs濃度的增加，纖維蛋白原凝固所需要的時間明顯減少。說明烏蘇里蝮蛇毒CLRPs可以促進(jìn)纖維蛋白原凝固。

3．6 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs對不同濃度纖維蛋白原凝固活性

結(jié)果見表2。隨著纖維蛋白原濃度的下降，凝固所需要的時間將延長。

3．7 時間對烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的纖維蛋白原水解活性影響

烏蘇里蝮蛇毒CLRPs與纖維蛋白原經(jīng)過不同時間反應(yīng)后，通過電泳圖譜檢測可見該蛋白優(yōu)先降解纖維蛋白原的α鏈，5 h后開始降解β鏈，而未能降解γ鏈(圖5)。分。通過SDS-PAGE和纖維蛋白原凝固活性測定、促凝血活性測定等多種生物活性測定方法對該組分的結(jié)構(gòu)特征和生物功能進(jìn)行檢測和評價，根據(jù)實驗結(jié)果，將其初步歸屬于CLRPs。

4 討論

本實驗利用IDA-Sepharose FF親和色譜和Sephadex G-100，Sephadex G-50凝膠過濾色譜等方法從長白山烏蘇里蝮蛇毒中得到了一種新的蛋白組

表1 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs對纖維蛋白原凝固活性的影響(x ± s，n=7)Tab．1 Coagulant activity of Gloydius ussuriensis venom C-type lectin-related protein on fibrinogen(x ± s，n=7)

表2 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs對不同濃度纖維蛋白原凝固活性的影響(x ± s，n=7)Tab．2 Coagulant activity of Gloydius ussuriensis venom C-type lectin-related protein on different concentrations of fibrinogen(x ± s，n=7)

在分離純化過程中，本實驗選用了IDA-Sepharose FF親和色譜對烏蘇里蝮蛇粗毒進(jìn)行初步的分離。IDA-Sepharose是一種以亞氨基二乙酸作為配基，與金屬離子形成金屬離子親和色譜，用以分離對重金屬有較強(qiáng)親和力的蛋白。由于IDA-Sepharose FF親和色譜可以與金屬離子結(jié)合，且大多數(shù)的CLRPs的結(jié)構(gòu)中含有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，因而CLRPs可以與IDA配基結(jié)合。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用IDA-Sepharose FF親和色譜能夠去除大多數(shù)非目的蛋白，而且蛋白得率較為理想。采用均一濃度和不同濃度的咪唑梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)使用分級梯度洗脫不僅可以最大程度減少非特異性吸附，提高分離效果，而且可以使目的蛋白集中地與IDA-Sepharose FF分離，增加洗脫效率。

圖5 烏蘇里蝮蛇毒CLRPs的纖維蛋白原水解電泳圖(T=12．5%)Fig．5 Fibrinogen degradation course anlysis of Gloydius ussuriensis venom C-type lectin-related protein by 12．5% SDSPAGE

［1］ Morita T．Structures and functions of snake venom CLPs(C-type lectin-like proteins)with anticoagulant-，procoagulant-，and platelet-modulating activities［J］．Toxicon，2005，45(8):1099-1114．

［2］ 李文輝，張 云．蛇毒C-型凝集素研究進(jìn)展［J］．動物學(xué)研究，2003，24(2):151-160．

［3］ 郭堯君．蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)［M］．2版．北京:科學(xué)出版社，2001:123-157．

［4］ Bradford M M．A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding［J］．Anal Biochem，1976，72(2):248-254．

［5］ Ouyang C，Teng C M．Fibrinogenolytic enzymes of trimeresurus mucrosquamatus venom［J］．Biochim Biophys Acta，1976，420(2):298-308．

Separation，purification and vital determination of a C-type agglutinin coherent protein in Gloydius ussuriensis toxin

LIU Li1，TIAN Gang1，SONG Yan2，SUN De-jun2
(1．Pharmaceutical Factory of Norman Bethune University of Medical Sciences，2．Department of Biomedicine，Institute of Frontier Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China)

Purpose To purify a C-type agglutinin coherent protein in Gloudius ussuriensis toxin．Methods Firstly by using IDA-sepharose FF affinity chromatography and sephadex G-100，sephadex G-50 filtration chromatography a new protein from Gloydius ussuriensis toxin has been separated．Results The new protein was idientified by reduction and non-reduction SDS-PAGE electrophovesis．It showed a singular zone and its molecular was 15．7 kD．In the protein biological activity determination，the results found that the protein had procoagulant activity directly and the activity had relevance to promoting its fibrinogen solidfy．They should belong to C-type agglutinin．Conclusion By the separation and purification，a C-type agglutinin coherent protein in Gloudius ussuriensis toxin could be obtained．

Gloydius ussuriensis;C-type agglutinin;separation and purification;vital determination

TQ464．9

A

1005-1678(2012)06-0805-04

2012-07-03

劉 立，男，碩士研究生，高級工程師，研究方向:生物技術(shù)藥物研究;孫德軍，通信作者，E-mail:sundjjl@yahoo．com．cn。